Clinical and molecular prospection of new therapeutic targets for myeloid neoplasms

A implementação de novas estratégias terapêuticas é dependente da elucidação de mecanismos não explícitos e da identificação de fatores clínicos e biológicos que particularizem pacientes para terapias ajustadas ao risco. Apesar do crescente interesse na implementação de terapias alvo, o reposicionamento de drogas tem ganhado notoriedade como estratégia para encurtar o tempo e os custos envolvidos na implementação de novas terapias. Através de investigação multi-experimental, objetivamos identificar novos preditores clínicos e fornecemos as evidências pré-clínicas para novas oportunidades terapêuticas em neoplasias mieloides. Utilizando modelo murino knockin com expressão condicionada da expressão Jak2V617F, investigamos os efeitos do tratamento com metformina na célula tronco hematopoiética (CTH) de neoplasia mieloproliferativa (NMP). O tratamento com metformina reduziu a esplenomegalia, frequência de progenitores eritroides precoces no baço e contagem de plaquetas no sangue periférico e a capacidade clonogênica de células mononucleares de medula óssea. Setenta e sete genes foram diferencialmente expressos entre células Kit enriquecidas de animais tratados com metformina em comparação aos tratados com veículo, dos quais 30 tiveram expressão diminuída e 47 aumentada. Sumariamente, o tratamento com metformina reduziu a esplenomegalia em modelo murino de NMP, mas não emerge como estratégia terapêutica curativa ao não afetar a frequência dos progenitores da NMP. Através de estratégia transcriptômica, desenvolvemos um índice prognóstico para pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) baseado na expressão de genes envolvidos nos processos de glicólise, fosforilação oxidativa e ciclo dos ácidos tricarboxílicos, por conveniência chamados de processos de energética celular. O índice molecular (MBS), foi capaz de estratificar pacientes em três grupos de risco distintos, sendo o risco adverso independentemente associado a sobrevida global inferior. O índice baseado em energética celular foi capaz também de distinguir molecularmente os pacientes utilizando análise de enriquecimento gênico, em que o aumento do risco esteve associado a progressão do ciclo celular, proliferação e indiferenciação da CTH. O MBS emerge como escore molecular de risco para pacientes com SMD e indica potenciais alvos para intervenção terapêutica. A via de sinalização do fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF1R) e dos substratos do receptor de insulina 1 e 2 (IRS1/2) tem importante função no desenvolvimento de diversas neoplasias, mas foram pouco estudados em leucemia mieloide aguda (LMA). A expressão de IGF1R, IGF2R, IRS1 e IRS2 foi determinada nas coortes de LMA do atlas do genoma do câncer (n=173) e do consórcio internacional de leucemia promielocítica aguda (n=105). A alta expressão de IGF1R e da razão de expressão de IGF1R/IGF2R identificaram pacientes com prognóstico desfavorável para LMA e LPA. A expressão diminuída de IRS1 foi associada a prognóstico desfavorável em pacientes com LMA. As linhagens celulares de LMA NB4, NB4-R2, Kasumi-1, THP1, Molm13 e MV4;11 foram tratadas com os inibidores de IGF1R-IRS1/2 linsitinibe e NT157 e submetidas a ensaios de citotoxicidade e funcionais. Coletivamente, o linsitinibe atuou como inibidor citostático e induziu autofagia como mecanismo limitante de sua eficiência, superado pela combinação com o inibidor de autofagia cloroquina. O NT157 foi um agente citotóxico em todas as linhagens, reduziu a proliferação celular, induziu apoptose, produção de espécies reativas de oxigênio e despolarização da membrana mitocondrial. Molecularmente, ambos os compostos inibiram as vias de IGF1R-IRS1/2, PI3K/AKT/mTOR, MAPK, induziram dano no DNA e clivagem de caspase 3. A ativação da via de MAPK de estresse celular foi ativada apenas em resposta a terapia com NT157, sugerindo ser um mecanismo não explícito específico desse composto. Em conclusão, a inibição farmacológica de IGF1R-IRS1/2 é uma oportunidade terapêutica promissora para LMA com eficiências e mecanismos distintos segundo o ponto de intervenção, receptor ou efetores citoplasmáticos.The implementation of new therapeutic strategies is dependent on the elucidation of non-explicit mechanisms and the identification of clinical and biological factors that distinguish patients for risk-adjusted therapies. Despite the growing interest in implementing target therapies, drug repositioning has gained notoriety as a strategy to shorten the time and costs involved in implementing new therapies. Through multi-experimental investigation, we aimed to identify new clinical predictors and provide preclinical evidence of new therapeutic opportunities in myeloid neoplasms. Using a knockin murine model with a conditioned expression of Jak2V617F expression, we investigated the effects of treatment with metformin on the hematopoietic stem cell (HSC) of myeloproliferative neoplasm (MPN). Treatment with metformin reduced splenomegaly, frequency of early erythroid progenitors in the spleen, platelet count in peripheral blood, and the clonogenic capacity of bone marrow mononuclear cells. Seventy-seven genes were differentially expressed between Kit-enriched cells from metformin-treated animals in comparison to those treated with vehicle, of which 30 were downregulated and 47 upregulated. In summary, treatment with metformin reduced splenomegaly in a murine model of MPN, but it does not emerge as a curative therapeutic strategy as it does not affect the MPN progenitors\' frequency. Through a transcriptomic strategy, we have developed a prognostic index for patients with myelodysplastic syndrome (MDS) based on the expression of genes involved in the processes of glycolysis, oxidative phosphorylation, and the tricarboxylic acids cycle, hereafter called cellular energetics processes. The molecular index (MBS) was able to stratify patients into three different risk groups. The adverse risk was independently associated with inferior overall survival. The score based on cellular energetics was also able to molecularly distinguish patients using gene-set enrichment analysis, in which the increased risk was associated with cell cycle progression, proliferation, and undifferentiation of HSC. MBS emerges as a molecular risk score for patients with MDS and indicates potential targets for therapeutic intervention. The signaling pathway of insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) and insulin receptor substrates 1 and 2 (IRS1/2) has an important role in the development of several neoplasms but were underexplored in acute myeloid leukemia (AML). The expression of IGF1R, IGF2R, IRS1, and IRS2 was determined in the AML cohorts of the cancer genome atlas (n=173) and the international consortium of acute promyelocytic leukemia (n=105). The high expression of IGF1R and the expression ratio of IGF1R/IGF2R identified patients with unfavorable prognosis for AML and APL. The decreased expression of IRS1 has been associated with an unfavorable prognosis in patients with AML. AML cell lines NB4, NB4-R2, Kasumi-1, THP1, Molm13, and MV4; 11 were treated with IGF1R-IRS1/2 inhibitors linsitinib and NT157 and subjected to cytotoxicity and functional assays. Collectively, linsitinib acted as a cytostatic inhibitor and induced autophagy as a limiting mechanism of its efficiency, surpassed by the combination with the chloroquine autophagy inhibitor. NT157 was a cytotoxic agent in all cell lines, reduced cell proliferation, induced apoptosis, production of reactive oxygen species, and depolarization of the mitochondrial membrane. Molecularly, both compounds inhibited the IGF1R-IRS1/ 2, PI3K/AKT/mTOR, MAPK pathways, induced DNA damage, and caspase cleavage 3. Activation of the MAPK pathway of cell stress was activated only in response to therapy with NT157, suggesting that it is a non-explicit mechanism specific to this compound. In conclusion, the pharmacological inhibition of IGF1R-IRS1/ 2 emerges as a promising therapeutic opportunity for AML with different efficiencies and mechanisms according to the point of intervention, receptor, or cytoplasmic effectors