Modulation of intracellular concentration of NAD+ and its effect on benzo[a]pyrene-induced tumorigenesis in human epithelial bronchial cells

A alta incidência, prevalência e mortalidade do câncer de pulmão demonstram a necessidade de se identificar alterações moleculares envolvidas na carcinogênese pulmonar. Nesse contexto, a reprogramação do metabolismo energético é uma marca emergente do câncer. Há evidências de que benzo[a]pireno (B[a]P), um conhecido carcinógeno humano, induz alterações metabólicas via modificação da função mitocondrial tanto in vitro quanto in vivo. Uma vez que as alterações metabólicas não são somente o resultado da transformação celular, mas podem também ter papel na etiologia do câncer ao modular o epigenoma e a expressão de genes, intervir no metabolismo de células em processo de transformação pode contribuir para desvendar mecanismos de carcinogênese e revelar alvos para quimioprevenção. A fim de investigar a relação entre alterações no metabolismo celular, marcas epigenéticas e transformação celular, implementamos um modelo de tumorigênese (avaliada pela formação de colônias em soft-agar) induzida por B[a]P em células epiteliais bronquiais humanas imortalizadas (linhagem BEAS-2B) crescidas em monocamada (2D). O modelo possibilitou a observação de alterações precoces do metabolismo celular. Levando em consideração que o nucleotídeo NAD+ regula as atividades de diversas vias moleculares importantes para a sobrevivência, diferenciação, crescimento e morte celular, e que suas concentrações foram rapidamente diminuídas após exposição a B[a]P, decidimos suplementar as células BEAS-2B com nicotinamida ribosídeo (NR), um precursor intracelular de NAD+, concomitantemente à exposição a B[a]P. NR em baixa concentração no meio de cultura (1 µM) induziu estresse energético em células BEAS-2B expostas a B[a]P (1 µM) ao longo do período de uma semana de co-incubação, aumentando seletivamente a taxa de apoptose dessas células. Protegeu contra a transformação celular induzida por B[a]P e impediu completamente a formação espontânea de colônias das células controle em soft-agar. Usamos uma abordagem metabolômica direcionada a alvos específicos (\"targeted metabolomics\") desenvolvida no grupo para quantificar metabólitos conhecidamente alterados no câncer. Os dados indicam que NR diminui o metabolismo de glutamina nas células expostas a B[a]P, o que ocorre em paralelo com a diminuição das concentrações de citrato e aspartato, aumento da razão malato/aspartato, diminuição das razões ATP/AMP e ATP/ADP e aumento das concentrações de adenosina. As alterações se enquadram na hipótese de inibição do shuttle malato-aspartato, cuja atividade é necessária para a sobrevivência de células que sofrem o efeito Warburg (alta dependência de NADH citosólico para geração de ATP). NR adicionalmente protegeu as células contra o estresse redox, a hipermetilação do DNA e o aumento da atividade de sirtuína 1 (SIRT1) induzidos por B[a]P, além de aumentar a expressão de genes supressores tumorais (E-caderina, PTEN, semaforina 3F, p16(ink4a)) que podem ser reprimidos por CtBP (proteína ligante de NADH que atua como sensor redox e traduz a condição metabólica da célula para o controle da expressão gênica). Foi ainda observada maior atividade de PARP1 nas células expostas a B[a]P+NR em comparação aos demais grupos. Os resultados obtidos mostram que NR se contrapõe a ou exacerba alterações bioquímicas induzidas por B[a]P, diminuindo a chance de transformação carcinogênica das células BEAS-2B. Estudos em modelos mais complexos, como micro tecidos in vitro, são necessários para a confirmação do efeito quimiopreventivo da NR e alterações bioquímicas subjacentes.The high incidence, prevalence and mortality of lung cancer demonstrates the need to identify molecular changes involved in lung carcinogenesis. In this context, the reprogramming of energy metabolism is an emerging brand of cancer. There is evidence that benzo[a]pyrene (B[a]P), a known human carcinogen, induces metabolic changes via modification of mitochondrial function both in vitro and in vivo. Since metabolic changes are not only the result of cell transformation, but can also play a role in the etiology of cancer by modulating the epigenome and gene expression, intervening in the metabolism of cells in the process of transformation can contribute to unravel mechanisms of carcinogenesis and reveal targets for chemoprevention. In order to investigate the relationship between changes in cell metabolism, epigenetic marks and cell transformation, we implemented a model of tumorigenesis (assessed by the formation of colonies on soft-agar) induced by B[a]P in immortalized human bronchial epithelial cells (BEAS-2B cell line human) grown in monolayer (2D). The model enabled the observation of early changes in cell metabolism. Taking into account that the NAD+ nucleotide regulates the activities of several molecular pathways important for cell survival, differentiation, growth and death, and that their concentrations were rapidly decreased after exposure to B[a]P, we decided to supplement the BEAS-2B cells with nicotinamide riboside (NR), an intracellular precursor of NAD+, concomitantly with exposure to B[a]P. NR in low concentration in the culture medium (1 µM) induced energy stress in BEAS-2B cells exposed to B[a]P (1 µM) over the period of a week of co-incubation, selectively increasing the apoptosis rate of these cells. It protected against cell transformation induced by B[a]P and completely prevented the spontaneous formation of control cell colonies on soft-agar. We use a targeted metabolomics approach developed in the group to quantify metabolites known to be altered in cancer. The data indicate that NR decreases the glutamine metabolism in cells exposed to B[a]P, which occurs in parallel with the decrease in citrate and aspartate concentrations, increased malate/aspartate ratio, decreased ATP/AMP and ATP/ADP ratios and increased adenosine concentrations. The changes fit the hypothesis of inhibition of the malate-aspartate shuttle, whose activity is necessary for the survival of cells that suffer the Warburg effect (high dependence on cytosolic NADH for ATP generation). NR additionally protected cells against redox stress, DNA hypermethylation and increased B[a]P-induced sirtuin 1 (SIRT1) activity, in addition to increasing the expression of tumor suppressor genes (E-cadherin, PTEN, semaphorin 3F, p16 (ink4a)) that can be suppressed by CtBP (NADH-binding protein that acts as a redox sensor and translates the cell\'s metabolic condition to control gene expression). Higher PARP1 activity was also observed in cells exposed to B[a]P+NR compared to the other groups. The results obtained show that NR is opposed to or exacerbates biochemical changes induced by B[a]P, reducing the chance of carcinogenic transformation of BEAS-2B cells. Studies on more complex models, such as micro tissues in vitro, are necessary to confirm the chemopreventive effect of NR and underlying biochemical changes