Phenotypic analysis and whole genome sequencing of Campylobacter coli strains isolated from different sources over 16 year-period in Brazil

Campylobacter spp., principalmente as espécies C. coli e C. jejuni, são a causa mais comum de doença bacteriana veiculada por alimentos em diversos países do mundo. No Brasil, há uma escassez de estudos de C. coli, o que dificulta avaliar a dimensão do envolvimento dessa bactéria como causadora de doença nos seres humanos e em animais, bem como, determinar o impacto de sua presença em alimentos e no meio ambiente. O objetivo geral desse trabalho foi caracterizar e analisar comparativamente por testes fenotípicos e sequenciamento do genoma completo, 63 linhagens de C. coli isoladas de fontes clínicas e não-clínicas. Nos testes fenotípicos foram estudadas 50 linhagens isoladas de humanos (12), animais (15), alimentos (8) e ambiente (15). Nos ensaios realizados tanto a 37ºC quanto a 4ºC, após 0,5h e 24 horas de incubação, a maioria das linhagens de C. coli estudadas apresentaram crescimento maior ou igual as linhagens controle Salmonella Typhimurium ATCC 14028 e C. jejuni ATCC 3329. Após a primeira hora de incubação em BHI suplementado com 7,5% de NaCl e em BHI ácido (pH=4,5) todas as linhagens estudadas permaneceram viáveis. Após 2 horas de incubação, um total de 13 linhagens incluindo 12 (24%) linhagens de C. coli e a linhagem controle S. Typhimurium ATCC 14028 apresentam 100% de sobrevivência na presença de 7,5% de NaCl. Da mesma maneira, seis linhagens de C. coli e os dois controles estudados apresentaram 100% de sobrevivência após 2 horas de incubação em BHI pH=4,5. Um total de 23 linhagens apresentaram crescimento após 24 horas de incubação em aerofilia e foram selecionadas para o ensaio de stress oxidativo para o qual 16 linhagens apresentaram dados de sobrevivência após 10 minutos de incubação. Dezessete linhagens de C. coli apresentaram porcentagens de invasão e sobrevivência, em células epiteliais Caco-2, maior ou igual à porcentagem apresentada pela S. Typhimurium ATCC 14028 (73,2%) e 50% das linhagens estudadas apresentaram porcentagens de invasão e sobrevivência maior ou igual a porcentagem apresentada pelo C. jejuni ATCC 33291 (64,6 %). No ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U-937 sete linhagens de C. coli apresentaram porcentagens de sobrevivência maior ou igual a que foi a apresentada pela S. Typhimurium ATCC 14028 (73,2 %) e todas as linhagens estudadas sobreviveram mais que o C. jejuni ATCC 33291 (30,4 %). No ensaio de sobrevivência em macrófagos de frango HD-11, duas linhagens apresentaram porcentagem de sobrevivência igual ou maior do que a apresentada pela S. Typhimurium ATCC 14028 (76,7 %) e 45 das 50 linhagens estudadas apresentaram porcentagens de sobrevivência igual ou maior a que foi apresentada pelo C. jejuni ATCC 33291 (46%). A pesquisa de genes de resistência para as 63 linhagens de C. coli estudadas revelou a presença do gene blaOXA-605 e blaOXA-61 em 54% dessas. O gene tet(O) foi detectado em 14 (22,2%) linhagens e mutações na região QRDR do gyrA foram detectadas em 8 (12,7%) linhagens. O gene cmeB foi detectado em 6 (9,5%) das linhagens estudadas e os genes aadE-Cc, aph(3\')-IIIa, sat4, aad9 foram detectados em 4 (6,3%), 1 (1,6%), 1 (1,6%) e 1 (1,6%) linhagens, respectivamente. A metodologia de MLST identificou 18 STs diferentes, sendo que 3 linhagens apresentaram STs novos ainda não descritos no banco de dados e 16 STs dentre os 18 STs encontrados pertencem ao Complexo Clonal (CC) 828. A análise filogenética do cgMLST agrupou as 63 linhagens estudadas em 5 clusters principais, que apresentaram uma alta diversidade genômica entre eles e foi observada uma alta similaridade genética entre algumas linhagens isoladas de diferentes fontes. A análise filogenética do cgMLST das 63 linhagens de C. coli isoladas no Brasil em comparação a 3.401 isolados de diversos países nos permitiu observar uma ampla distribuição das 63 linhagens de C. coli e que algumas dessas linhagens isoladas no Brasil apresentam uma alta similaridade genética entre elas. Conclui-se que o comportamento das C. coli estudadas frente a diferentes condições de stress é provavelmente linhagem-dependente. A alta capacidade de invasão e sobrevivência em células epiteliais Caco-2 e em macrófagos U-937 e HD-11 reforça o potencial patogênico dessas linhagens. A alta frequência do gene blaoxa605 (blaoxa61) é preocupante e pode levar a falha terapêutica quando o tratamento é realizado com β-lactâmicos. As análises do MLST e cgMLST demonstraram uma alta similaridade entre algumas linhagens estudadas sugerindo que o meio ambiente e os alimentos tem sido uma possível fonte de contaminação e/ou transmissão para humanos e animais no Brasil.Campylobacter spp., mainly the C. coli and C. jejuni species, are the most common cause of bacterial foodborne disease worldwide. In Brazil, there is a paucity of studies on C. coli, which makes it difficult to evaluate the involvement of this bacterium as a cause of diseases in humans and animals, as well as to determine the impact of its presence in food and the environment. The main aim of this study was to characterize and analyze comparatively by phenotypic tests and whole genome sequencing 63 C. coli strains isolated from clinical and non-clinical sources. The phenotypic tests were performed using 50 C. coli strains isolated from humans (12), animals (15), food (8) and the environment (15). In tests performed at both 37ºC and 4ºC, after 0.5 h and 24 hours of incubation, the majority of the C. coli studied grew more than or equal to the control strains Salmonella Typhimurium ATCC 14028 and C. jejuni ATCC 3329. After the first hour of incubation in BHI with a final concentration of 7.5% NaCl (wt/vol) and BHI pH=4.5 all the strains remained 100% viable. After two hours of incubation in BHI with a final concentration of 7.5% NaCl (wt/vol), a total of 13 strains including 12 (24%) C. coli strains plus the control strain S. Typhimurium ATCC 14028 showed 100% survival. Likewise, six C. coli strains plus the two controls strains studied showed 100% survival after 2 hours of incubation in BHI pH=4,5. A total of 23 strains exhibited growth after incubation at 42°C under aerophilic conditions for 24 hours and were select to oxidative stress tests for which 16 strains survived during 10 minutes of incubation. Seventeen C. coli strains showed invasion and survival percentage, in epithelial Caco-2 cells greater than or equal to the percentage (73.2%) showed by S. Typhimurium ATCC 14028 and 50% of the studied strains showed percentages of survival greater than or equal to the percentage presented by C. jejuni ATCC 33291 (64.6%). In the human macrophage U-937 survival assay, seven C. coli strains showed percentages of survival greater than or equal to the percentage showed by S. Typhimurium ATCC 14028 (73.2%) and all the strains studied showed percentages of survival greater than C. jejuni ATCC 33291 (30.4 %). In the chicken macrophage HD-11 survival assay, two strains showed percentages of survival greater than or equal to the percentage presented by S. Typhimurium ATCC 14028 (76.7 %) and 45 of 50 strains studied showed percentages of invasion and survival greater than or equal to the percentage presented by C. jejuni ATCC 33291(46%). The search of resistance genes in the 63 C. coli strains studied revealed the presence of blaOXA-605 e blaOXA-61 gene in 54% of them. The tet(O) gene was detected in 14 (22.2%) strains and QRDR gyrA mutations was detected in 8 (12.7%) strains. The cmeB gene was detected in 6 (9.5%) of the strains studied and the aadE-Cc, aph(3\')-IIIa, sat4, aad9 genes were detected in 4 (6.3%), 1 (1.6%), 1(1.6%) e 1(1.6%) strains, respectively. The MLST methodology identified 18 different STs being that 3 strains showed new STs not yet described in the database and 16 out of the 18 STs founded belong to the Clonal Complex (CC) 828. The phylogenetic analysis by cgMLST clustered the 63 C. coli strains into 5 main cluster which presented a high genomic diversity among them and a high genomic similarity among some strains isolated from different sources was observed. The phylogenetic analysis by cgMLST of the 63 C. coli strains isolated in Brazil in comparison to 3,401 isolates from different countries allows us to observe a wide distribution of the strains studied and a high genetic similarity among some strains isolated in Brazil. It can be concluded that the behavior of C. coli studied under different stress conditions is probably strain-dependent. The high invasion and survival capacity in Caco-2 epithelial cells and in U-937 and HD-11 macrophages reinforces the pathogenic potential of these strains. The high frequency of the blaoxa605 (blaoxa61) gene is of concern and may lead to therapeutic failure when treatment is done using β-lactams. The MLST and cgMLST analyzes showed a high similarity among some strains studied suggesting that the environment and food have been a possible source of contamination and / or transmission to humans and animals in Brazil