Modificación de la variabilidad genética de una población de Physalis peruviana L. para una agricultura sustentable

Universidad Nacional Agraria La Molina. Escuela de Posgrado. Doctorado en Agricultura SustentableEl aguaymanto (Physalis peruviana L.), importante por su valor económico y nutritivo, requiere de estudios que apunten a reducir el tamaño de planta, el periodo vegetativo, entre otros. Los objetivos del presente trabajo fueron: (i) determinar el efecto de los rayos gamma y de la azida de sodio para inducir cambios genéticos en el aguaymanto; (ii) determinar el nivel de ploidía de la población M0 (iii); caracterizar molecularmente la población M0 y M1 y (iv) evaluar las características morfológicas de las plantas M2. Para el objetivo 1 se instalaron dos experimentos independientes, los que fueron conducidos tanto en laboratorio como en el vivero. En el primer experimento se aplicó a las semillas la radiación gamma con dosis de 0 Gy, 100 Gy, 150 Gy, 200 Gy, 250 Gy, 300 Gy, 350 Gy y 400 Gy. En el segundo experimento, las semillas fueron remojadas en azida de sodio a dosis de 0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 y 3,5 mM.; además se incluyó una solución Buffer pH3. Ambos experimentos fueron conducidos en el diseño completamente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento. Para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey. Se evaluaron % de germinación radicular, % de germinación cotiledonal, longitud de raíz (mm), % de emergencia y altura de plantas (mm). Para el objetivo 2 se hicieron germinar 100 plántulas. Cuando tenían de cuatro a cinco hojas verdaderas, se seleccionaron al azar 30 individuos. Se utilizó el protocolo del manual de biología reproductiva y citológica de la papa (Ordoñez et al., 2016). Para el objetivo 3 se realizó la extracción de ADN en base a la metodología de Dellaporta et al. (1983), seguidamente se realizó la amplificación de los microsatélites ISSR vía PCR con seis primers, escogidos por manifestar polimorfismo y repetibilidad; finalmente, los amplificados se separaron por electroforesis (1 hora en Tampón TBE 0,5 X a 160 V) en geles de poliacrilamida al 8%, usando sales de plata para la tinción. La visualización de los geles se hizo directamente sobre ellos, utilizando un fondo de luz blanca. El peso de los amplificados, se estimó por comparación con el marcador Lambda de 100 pb. Para el objetivo 4 se hicieron germinar 10 semillas de 200 plantas proveniente de la población M1 (2.5 mM de azida de sodio y 300 Gy de radiación gamma). Cuando las plántulas tenían aproximadamente 10 cm de altura, se trasplantó en el terreno definitivo un total de 2000 plántulas de cada tratamiento en parcelas independientes de observación, distanciados entre surcos a 1.50 m. y a 1.50 m. entre plantas. Cada 5 surcos de plántula tratadas, se sembró 2 surcos de plántulas sin tratamiento (testigo), para facilitar la comparación. La identificación de variantes mutagénicos en plantas individuales, fue visualmente comparando con las plantas sin tratamiento (testigo). Se evaluaron caracteres morfológicos y se seleccionaron 12 aquellos individuos diferentes con caracteres agronómicos deseados. Como resultados se desprenden: (i) las dosis de los agentes mutagénicos rayos gamma y azida de sodio empleados tuvieron efectos reductores y estimuladores en la germinación, emergencia, longitud de raíz y altura de plántula. Notándose una tendencia de mayor reducción con el incremento de la dosis; (ii) las plantas de la población M0 está constituida de plantas con 2n=48 cromosomas; (iii) la caracterización molecular de la población M0, demostró ser una población homogénea y la caracterización molecular de 29 plantas M1 determino la existencia de cuatro grupos y dos genotipos independientes; (iv) los agentes mutagénicos rayos gamma y del azida de sodio en las dosis de 300 Gy y 2,5 mM indujeron cambios diferentes al testigo en caracteres morfológicos y de precocidad considerados como mutantes probables.The aguaymanto (Physalis peruviana L.), important for its economic and nutritional value, requires studies that aim to reduce the size of the plant, the vegetative period, among others. The objectives of this work were: (i) to determine the effect of gamma rays and sodium azide to induce genetic changes in aguaymanto; (ii) determine the ploidy level of the M0 population (iii); molecularly characterize the population M0 and M1 and (iv) evaluate the morphological characteristics of the M2 plants. For objective 1, two independent experiments were installed, which were conducted both in the laboratory and in the nursery. In the first experiment, gamma radiation was applied to the seeds with doses of 0 Gy, 100 Gy, 150 Gy, 200 Gy, 250 Gy, 300 Gy, 350 Gy and 400 Gy. In the second experiment, the seeds were soaked in sodium azide at a dose of 0.0; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0 and 3.5 mM; in addition, a buffer pH3 solution was included. Both experiments were conducted in a completely randomized design with four replications per treatment. For the comparison of means, the Tukey test was used. % Root germination, % cotyledonal germination, root length (mm), % emergence and plant height (mm) were evaluated. For objective 2, 100 seedlings were germinated. When they had four to five true leaves, 30 individuals were randomly selected. The protocol of the potato reproductive and cytological biology manual was used (Ordoñez et al., 2016). For objective 3, the DNA extraction was carried out based on the methodology of Dellaporta et al. (1983), then the ISSR microsatellites were amplified via PCR with six primers, chosen for showing polymorphism and repeatability; finally, the amplified ones were separated by electrophoresis (1 hour in TBE Buffer 0.5 X at 160 V) in 8% polyacrylamide gels, using silver salts for staining. The visualization of the gels was done directly on them, using a white light background. The weight of the amplified ones was estimated by comparison with the Lambda marker of 100 bp. For objective 4, 10 seeds of 200 plants from the M1 population were germinated (2.5 mM of sodium azide and 300 Gy of gamma radiation). When the seedlings were approximately 10 cm tall, a total of 2000 seedlings from each treatment were transplanted into the final field in independent observation plots, spaced between rows at 1.50 m. and at 1.50 m. between plants. Every 5 treated seedling rows, 2 seedling rows were sown without treatment (control), to facilitate comparison. The identification of mutagenic variants in individual plants was visually compared with the plants without treatment (control). Morphological characters were evaluated and those different individuals with desired agronomic characters were selected. The results are: (i) the doses of the mutagenic agent’s gamma rays and sodium azide used 14 had reducing and stimulating effects on germination, emergence, root length and seedling height. Noting a trend of greater reduction with the increase of the dose; (ii) the plants of the M0 population are made up of plants with 2n = 48 chromosomes; (iii) the molecular characterization of the M0 population proved to be a homogeneous population and the molecular characterization of 29 M1 plants determined the existence of four groups and two independent genotypes; (iv) the mutagenic agents gamma rays and sodium azide at the doses of 300 Gy and 2.5 mM induced changes different from the control in morphological and precocious characters considered as probable mutants