Neuronostatin, connective tissue growth factor and glycogen synthase kinase 3β in cardiac physiology and disease

Abstract Cardiovascular diseases are the leading cause of death in Western countries. The aim of my thesis was to increase understanding of the signaling pathways regulating progression of cardiac remodeling from myocardial infarction injury and cardiac hypertrophy to heart failure. In these preclinical studies, I focused on the factors regulating cardiomyocyte survival, hypertrophy and extracellular matrix modulation. There were three different factors in my studies; neuronostatin (NST), connective tissue growth factor (CTGF) and glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). NST is a peptide found in various organs, including heart. I found that NST has an attenuating effect on endothelin-1 -induced left ventricular (LV) contractility in isolated perfused rat heart which is also followed by increased phosphorylation of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and c-jun N-terminal kinase (JNK). NST also reduced survival of the cultured cardiomyocytes, which was further compromised by JNK inhibition. CTGF has a physiological role in tissue repair and it is overexpressed in almost all fibrotic diseases as well as in cardiac fibrosis and atherosclerosis. In my studies therapy with a CTGF monoclonal antibody (mAb) improved survival, attenuated infarct expansion and preserved LV systolic function during cardiac repair after myocardial infarction (MI) in mice. LV fibrosis, MI-induced cardiomyocyte hypertrophy and increase in LV mass were all attenuated with CTGF mAb treatment during post-MI LV remodeling. These changes were associated with reduced inflammatory and pro-fibrotic gene activation and enhanced expression of genes related to cardiac development and/or repair. In vitro -studies with human fibroblasts showed a role for JNK in reducing collagen production by the CTGF mAb. GSK3β is a serine/threonine kinase first identified as a negative regulator of glycogen synthase. It also has an important role in cardiac hypertrophy and cell death. My key finding was that phosphorylation of the GSK3β S389 site is cardioprotective and antihypertrophic in cultured cardiomyocytes. In conclusion, these three factors, NST, CTGF, and GSK3β, contribute to cardiomyocyte survival, hypertrophic response and fibrotic response of cardiac remodeling. This knowledge may eventually lead to development of targeted therapies to decrease and prevent cardiac injury.Tiivistelmä Sydän- ja verisuonitaudit ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa. Väitöskirjani tarkoitus on lisätä ymmärrystä sydämen solujen signaalireiteistä, jotka säätelevät sydäninfarktista ja sydämen vasemman kammion liikakasvusta seuraavaa vasemman kammion haitallista uudelleen muovautumista ja johtavat sydämen vajaatoimintaan. Prekliinisessä tutkimuksessani keskityin tekijöihin, jotka säätelevät sydänlihassolun selviytymistä, liikakasvua ja soluväliaineen muokkausta. Tutkin kolmea eri tekijää: neuronostatiinia (NST), sidekudoksen kasvutekijää (CTGF) ja glykogeenisyntaasikinaasi 3β:tä (GSK3β). NST on peptidi, jota on löydetty useista elimistä, myös sydämestä. Tutkimuksissani NST heikensi endoteliini-1:n indusoimaa sydämen supistuvuutta rotan eristetyssä perfusoidussa sydämessä lisäten myös p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja JNK:n (engl. c-Jun N-terminal kinase) fosforylaatiota. NST lisäsi myös viljeltyjen sydänlihassolujen kuolleisuutta, jota JNK:n estäminen vielä lisäsi. CTGF:lla on fysiologinen rooli kudosten korjautumisessa, ja sen määrä on lisääntynyt lähes kaikissa sidekudosta lisäävissä sairauksissa, myös sidekudostuvassa sydämessä ja valtimokovettumataudissa. Hiiren kokeellisen sydäninfarktin hoito CTGF:n monoklonaalisella vasta-aineella infarktin korjaantumisvaiheessa paransi eloonjäämistä, vähensi infarktin laajenemista ja hidasti sydämen toiminnan heikkenemistä. Vasemman kammion uudelleen muovautumisen vaiheessa hoito vähensi sydämen sidekudostumista ja liikakasvua. Taustalla nähtiin vähäisempi nousu tulehduksellisissa ja sidekudosta lisäävissä geeneissä ja lisääntynyt nousu sydämen kehitykseen ja korjautumiseen liittyvissä geeneissä. Vasta-aineella hoidetuissa viljellyissä ihmisen fibroblastisoluissa JNK näytti välittävän vähentynyttä kollageenin eritystä. GSK3β on seriini-treoniini -kinaasi, jonka ensin havaittiin säätelevän negatiivisesti glykogeenisyntaasia. Sillä on myös merkittävä rooli sydämen vasemman kammion liikakasvussa ja solukuolemassa. Tärkein löydökseni on, että eristetyissä sydänlihassoluissa GSK3β S389 -kohdan fosforylaatio suojaa soluja solukuolemalta ja liikakasvulta. Johtopäätöksenä voin todeta näiden kolmen tutkimani tekijän, NST:n, CTGF:n ja GSK3β:n, olevan osallisina sydämen vasemman kammion uudelleen muovautumisessa; solukuolemassa, liikakasvussa ja sidekudosvasteessa. Tämän väitöskirjan tuoma lisätieto voi johtaa paremmin kohdennettuihin sydänvaurioiden hoitoihin