DISSECTION DU MÉCANISME DE TERMINAISON/ANTITERMINAISON AU NIVEAU DU TERMINATEUR TRI DU PHAGE LAMBDA : APPLICATION A L'ÉTUDE DES COMPLEXES ARN-PROTÉINE IN VIVO

RAHMOUNI Rachid, Directeur de thèse BOSSI Lionello, Rapporteur KOLB Annie, Rapporteur HEVOR Tobias, Examinateur PAOLETTI Jacques, ExaminateurIn Escherichia coli transcription termination can occur by two distinct mechanisms: intrinsic termination corresponds to a signal on the template DNA, coding for a GC rich stem-loop structure followed by a strech of U residues on the RNA, that promotes the releasing of the RNA polymerase from the template DNA. The second mechanism is governed by a termination factor called Rho. Rho is responsible for approximately half of the termination processes in E. coli. During my PhD thesis I have focused on this second mechanism, and specially its regulation in vivo (antitermination). Rho acts as a ringshaped hexamer, it binds to the nascent RNA at a Rho loading site (also called RUT), then translocates along the RNA, using its ATP hydrolysis activity and dissiociate the transcription elongation complex stalled at a pause site. Rho dependent terminators have low defined sequences and very few have been analysed in details. The lambda (λ) tR1 is the classical paradigm for Rho-dependant termination that has been well studied both in vitro and in vivo. Rho-dependant transcription termination at he phage λtR1 terminator is governed primarily by the upstream rut element that encode two RNA regions RUTA and RUTB. The two regions are separated by BOXB RNA motif which is believed to be dispensable for Rho activity but serves as a binding site for λ N protein in the antitermination process. By using a minimal in vivo termination system we have shown that the intervening BOXB RNA motif has a double function in the mechamism of termination antitermination at λtR1 that regulate the temporal expression of the phage λ genome. As a folded stem-loop structure, BOXB acts as a hinge that brings RUTA and RUTB side by side for optimal interaction with Rho leading to efficient termination. Conversely, the binding of N protein to BOXB induces antitermination at λtR1 by preventing access of Rho to the rut sequence. This dual role was clearly demonstrated in vivo by substituting the N/BOXB couple with the unrelated coat protein of phage MS2 and its stem-loop RNA target. In addition to this work, I have used this property of a nucleo-protein complex to block transcription termination by Rho, to develop a new and versatile approach for studying, in vivo, RNA-protein complexes.Chez Escherichia coli la terminaison de la transcription peut intervenir selon deux mécanismes distincts : tout d'abord la terminaison intrinsèque qui correspond à une séquence ADN, codant pour une structure en tige boucle riche en GC suivie d'une répétition d'uridine sur l'ARN, induisant le relargage de l'ARN polymérase. Le second mécanisme est gouverné par un facteur de terminaison nommé Rho qui gouverne environ 50 % des événements de terminaison chez E. coli. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à ce deuxième mécanisme, et plus particulièrement à sa régulation in vivo (antiterminaison). Rho, sous la forme d'un anneau héxamèrique, se fixe à l'ARN naissant au niveau d'un site d'entrée (également appelé RUT), puis utilise son activité ATPase pour longer l'ARN et dissocier le complexe ternaire d'élongation stoppé au niveau d'un site de pause. Les terminateurs Rho-dépendants sont assez mal définis et peu d'entre eux on été analysés en détail. Le terminateur du tR1 du phage lambda (λ) est le terminateur Rho-dépendant le plus étudié à la fois in vitro et in vivo. La terminaison Rho-dépendante au niveau de ce terminateur est gouvernée principalement par les séquences localisées en 5', codant deux régions du transcript nommées RUTA et RUTB. Ces deux régions sont séparées par le motif ARN BOXB qui n'est pas indispensable à l'action de Rho mais sert, dans le mécanisme d'antiterminaison, de site de fixation pour la protéine N du paghe λ. Grâce à un système minimal d'étude in vivo, nous avons montré que le motif BOXB possède une fonction double dans les mécanismes de terminaiso/antiterminaison au niveau de λtR1 régulant l'expression temporale du génome du phage λ. Sous la forme d'une tige boucle hautement structurée, BOXB agit comme un lien permettant de placer RUTA et RUTB l'un à côté de l'autre pour une interaction optimale avec Rho et une terminaison efficace. A l'inverse, la fixation de la protéine N sur BOXB induit l'antiterminaison au niveau de λtR1 en empêchant l'accès de Rho à l'ARN. Ce double rôle a été démontré in vivo en substituant au couple N/BOXB la « coat protein » du phage MS2 et son motif cible en tige boucle. En complément de ce travail, j'ai utilisé cette faculté d'un complexe ribonucléoprotéïque de bloquer la terminaison Rho-dépendante, pour développer une nouvelle approche d'étude in vivo, des complexe ARN-protéine