Spectroscopie de fluorescence dynamique confocale : réalisation du dispositif optique et application à l'étude de l'adsorption de protéines aux interfaces solide/liquide.

The comprehension of the phenomena of adsorption of proteins to the solid-liquid interfaces is a key element in the design and the use of artificial membranes and biocompatible materials. In front of the complexity of the phenomena, the fundamental studies and their modelization have a strategic importance. The techniques of time resolved fluorescence and polarization of fluorescence permit et weak concentration to obtain information both the direct environment and the movement of a fluorescent molecule. In addition, the confocal fluorescence techniques make possible as for them the visualization of a volume of the order of the femtolitre and perfectly localised. We developed an innovating optical device allowing to carry out studies of adsorption under flow by measurements of time resolved fluorescence and polarization of fluorescence in confocal mode. The intrinsic fluorescence of proteins or direct labelin by fluorophore was not a simple system to study the movements of proteins. The solution was to carry out a marking of the avidine by using its strong affinity for the biotin. We synthesized a fluorescent probe composed of biotin ethylenediamine and alexa fluorine 594. This probe forms a very stable complex with the avidin. Finally, we observed the evolution of the profile of concentration during the phenomenon of adsorption. We observed the kinetics of adsorption and the impact over the fluorescence lifetime and the correlation time of the avidine adsorbed on a model surface (mica) and on a hemodialysis membrane (AN-69).La compréhension des phénomènes d'adsorption des protéines aux interfaces solides liquides est un élément clé dans la conception et l'utilisation de membranes artificielles et de matériaux biocompatibles. Devant la complexité des phénomènes, les études fondamentales et leurs modélisations revêtent une importance stratégique. Les techniques de fluorescence et de polarisation de fluorescence résolues dans le temps permettent à de très faible concentration d'obtenir des informations tant sur l'environnement direct que sur le mouvement d'une molécule émettrice. Par ailleurs, les techniques de fluorescence confocales rendent possibles quant à elles la visualisation d'un volume parfaitement localisé de l'ordre du femtolitre. La fluorescence intrinsèque des protéines ou le marquage direct par un chromophore ne rendent pas toujours compte simplement du mouvements des protéines. De ce fait, Nous avons synthétisé une sonde fluorescente composée de biotine éthylènediamine et d'alexa fluor 594. Ce marquage permet d'obtenir un temps de corrélation unique l de 32 ns, compatible à celui attendu pour une protéine de géométrie sphérique de masse molaire de 66 KDa. Durant ce travail de thèse, nous avons développé un dispositif optique innovant permettant d'effectuer des études d'adsorption sous flux par des mesures de fluorescence et de polarisation de fluorescence résolues dans le temps en mode confocal. Le dispositif mise au point permet d'obtenir une résolution spatial de 1,2 µm soit un volume de l'ordre du femtolitre qu'il est possible de déplacer dans une cuve d'épaisseur de 230 µm. En fluorescence dynamique, les valeurs de temps de corrélation et de durée de vie de fluorescence obtenue sont similaires avec ceux obtenus en mesure de fluorescence classique.Enfin, nous avons suivi la cinétique d'adsorption et l'évolution des profile de concentration de l'avidine lors du processus d'adsorption sur une surface modèle (mica) et sur une membrane d'hémodialyse (AN-69)