Etude de l'ATPase Ca2+ du réticulum sarco/endoplasmique : Mise au point d'une nouvelle méthode de purification de SERCA1a de lapin exprimée chez S. cerevisiae permettant sa cristallisation et applications au mutant E309Q-Etude d'une autre isoforme, SERCA3a

We describe here a new purification method of the rabbit SERCA1a after its heterologous expression in the yeast S. cerevisiae . A “biotin acceptor domain” is fused at the C-terminal part of the protein and is biotinylated in vivo by the yeast. The purification procedure, based on the strong interaction between avidin and biotin, allows us to obtain a protein pure at 40-50% and well active. After an additional purification step by SEC-HPLC the protein is pure at about 70% and always well active. Crystals were obtained from SERCA1a purified by this method and they diffract X-rays at 3,1 Å.This new method was used with sucicess to purify the mutant E309Q. Small crystals of the mutant were obtained. SERCA3a could also be purified using this procedure, but the low yield of expression limits the amount that could be purified. In parallel, immunolocalization of SERCA3a was performed in several cell lines and in cryosections of skin.Dans cette thèse est présentée une nouvelle stratégie de purification de SERCA1a après son expression hétérologue chez S. cerevisiae.. La protéine est fusionnée à un domaine accepteur de biotine, biotinylé in vivo par la levure. La procédure de purification, basée sur la forte interaction entre avidine et biotine, permet d'obtenir une protéine active pure à 40-50%. Une étape supplémentaire de filtration sur gel en HPLC a permis d'augmenter la pureté d'environ 70%, tout en conservant une très bonne activité spécifique. Les cristaux obtenus de SERCA1a ainsi purifiée diffractent les rayons X à 3,1Å. Cette nouvelle méthode de purification a été appliquée avec succès au mutant SERCA1a-E309Q. De petits cristaux de ce mutant ont pu être isolés. Cette méthode a également permis de purifier SERCA3a, bien que le faible taux d'expression de la protéine de fusion chez S. cerevisiae limite la quantité purifiée. En parallèle, des essais d'immunolocalisation cellulaire de SERCA3a dans différentes lignées cellulaires et dans des coupes de peau ont été réalisé