Dynamique spatio-temporelle et régulation de l'activité de la<br />protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate cyclique<br />dans des préparations de neurones en tranche<br />et<br />Les mécanismes cellulaires d'action du GHB dans le thalamus<br />ventrobasal.

Dans le système nerveux central, le principal effecteur de la voie de transduction de l'AMPcest la protéine kinase activée par l'AMPc (PKA). L'activation de la PKA est impliquée dans denombreux processus comme la modulation de l'excitabilité neuronale par phosphorylation decanaux ioniques, de l'homéostasie cellulaire par phosphorylation de cibles cytosoliques et de larégulation génique par phosphorylation de facteurs de transcription. La régulation de l'activité de laPKA ainsi que son activation spatiale et temporelle sont des paramètres indispensables à lacompréhension des mécanismes cellulaires à l'origine des effets de cette voie de seconds messagers.Faute d'approches méthodologiques adaptées, très peu d'études se sont intéressées à la dynamiquespatiale et temporelle, à la spécificité et à la régulation de l'activité de la PKA dans les neurones.Grâce aux sondes fluorescentes codées génétiquement, il est possible maintenant d'avoiraccès à ces paramètres. A l'aide d'un vecteur viral, nous avons fait exprimer une sonde sensible àl'activité PKA (sonde AKAR pour A-kinase activity reporter) dans des préparations de neurones entranches. Cette sonde utilise le principe du transfert d'énergie par résonance (FRET) et permet demesurer par imagerie ratiométrique l'activité kinase de la PKA. Nous avons montré que la sondeAKAR2, exprimée dans les neurones, modifie son spectre d'émission en réponse à une stimulationde la voie AMPc. L'utilisation d'une sonde mutante, dont le site de phosphorylation a été modifié,démontre que les changements observés dans le spectre d'émission de la sonde AKAR2 sont bienattribuables à une phosphorylation.Dans une première partie, nous avons étudié la phosphorylation de protéines cibles de laPKA dans différents compartiments subcellulaires en réponse à différentes stimulationsextracellulaires. La phosphorylation de la sonde AKAR2, nous a permis de suivre en temps réell'activité de la PKA dans le cytosol. Afin de mesurer l'activité de la PKA dans le noyau, nous avonsadressé la sonde AKAR2 en utilisant un signal de localisation nucléaire (NLS). Enfin, la mesure del'activité de la PKA à la membrane a été réalisée grâce à l'étude de la phosphorylation des canauxresponsables du courant de l'AHP lente (IsAHP). Nous avons montré que la phosphorylation descanaux ioniques est plus rapide que la phosphorylation des cibles cytosoliques, elles-mêmes plusrapide que la phosphorylation des protéines nucléaires. De plus, nous avons montré que l'activité dela PKA stimulée par l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est différente del'activation directe des adénylyl cyclases (AC). En effet, l'activation de la PKA résultant de lastimulation des RCPG produit des amplitudes de phosphorylation plus faible de la sonde AKAR2dans le cytosol et le noyau.Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle des phosphodiestérases de type 4(PDE4) dans la régulation des réponses β-adrénergiques. L'inhibition des PDE4 produit uneactivation de la PKA dans les neurones traduisant ainsi une activité tonique des AC. Nous montronségalement que l'inhibition des PDE4 permet de potentialiser l'activité de la PKA en réponse à defaibles concentrations d'agonistes β adrénergiques. Cette famille de PDEs, en dégradant l'AMPc,participe donc à la régulation et la propagation des signaux PKA dans les neurones.Enfin, au cours de ma thèse, je me suis également intéressé au γ-hydroxybutyrate (GHB)composé qui est utilisé pour soigner certains troubles du sommeil et provoque chez le ratl'apparition de signes comportementaux et de tracés encéphalographiques similaires à ceux observéschez l'humain lors de crises d'épilepsie de type absence. L'ensemble de ces effets du GHB passeprobablement par une action sur la boucle thalamocorticale mais les mécanismes cellulaires à leursorigines sont inconnus. Nous avons montré grâce à l'utilisation d'enregistrementsélectrophysiologiques, que les courants post-synaptiques inhibiteurs sont beaucoup moins sensiblesau GHB que les courants post-synaptiques excitateurs et les courants potassiques à rectificationentrante (GIRK). Cette différence de sensibilité serait à l'origine d'un déséquilibre de la balanceexcitation/inhibition reçue par les neurones thalamocorticaux ce qui participerait à la genèse d'uneactivité oscillante du potentiel membranaire de ces neurones