Identification et caracterisation des Glutaredoxines de la cyanobacterie Synechocystis

Le maintien de l'homéostasie rédox des thiols, dépendant du pouvoir réducteur duNADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposéesdistinctes : 1) thiorédoxine réductase/thiorédoxines et 2) glutathionréductase/glutathion/glutarédoxines. En dépit de leur importance, on connaît mal la spécificitédes glutarédoxines et des thiorédoxines [1]. C'est particulièrement vrai chez les organismesphotosynthétiques, dont le métabolisme rédox, dépendant de la photosynthèse, est essentiel àla biosphère (production d'oxygène, assimilation du carbone et de l'azote inorganiquesnécessaires à la production de biomasse pour la chaîne alimentaire). La photosynthèse,comme la respiration, produit des molécules oxydantes (les espèces activées de l'oxygène) quiperturbent, entre autres, l'homéostasie rédox des thiols.Dans le cas des glutarédoxines, il a été montré, chez les organismes hétérotrophes, que cesenzymes utilisent le pouvoir réducteur du glutathion (re-réduit par le NADPH via laglutathion réductase) pour contrôler l'état rédox des thiols des résidus cystéines (Cys) desprotéines (réduire les ponts disulfure inter- ou intra-moléculaires). Les glutarédoxines serépartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre rédox actif : lesglutarédoxines à dithiol (possédant un site actif de type CysXXCys) et les glutarédoxines àmonothiol (avec un site actif de type CysXXSer).Au cours de ma thèse, j'ai analysé, in vitro et in vivo, les glutarédoxines avec un organismephotosynthétique modèle: la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis PCC6803(Synechocystis), qui possède un petit génome (3,57 Mb) entièrement séquencé etgénétiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques développés au laboratoire.Synechocystis possède 3 glutarédoxines (Grx): deux à dithiol (Grx1 et Grx2) et une àmonothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactivé les 3 gènes correspondants,indépendamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles et triple) sontparfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolérance auxstress diffère de celle de la souche sauvage. Le mutant Dgrx1 est sensible au mercure (HgCl2)et à l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant Dgrx2 est sensible au peroxyde d'hydrogène(H2O2), au cadmium (CdSO4) et au sélénate (NaSeO4). Le mutant Dgrx3 est sensible au bleude méthylène. Le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 est sensible à chacun des toxiquesprécédemment cités, et aussi, de façon spécifique par rapport aux autres mutants, à un excès(x25) de zinc (ZnCl2). Ces résultats indiquent que les Grx possèdent une certaine sélectivité,qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions spécifiques.11Pour rechercher des partenaires protéiques des Grx, j'ai utilisé un système bactérien de"double hybride", basé sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, indépendamment, lesgènes codant pour les protéines "appâts" (chacun des trois gènes grx) et les protéines "proies"(les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernières, nous avons cloné,indépendamment, une cinquantaine des gènes impliqués dans métabolisme rédox, sans selimiter au contrôle de l'homéostasie rédox des thiols. Les 1000 tests d'interaction réalisésnous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite,j'ai analysé les interactions (1) Grx1-MerA (MerA est la réductase du mercure) et (2)thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutagenèsesdirigées, tests double hybride et études in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et(iii) tests d'activité in vitro.J'ai montré que l'activité de réduction du mercure de MerA est inhibée, de façon réversible,par la glutathionylation (fixation d'une molécule de glutathion) d'une cystéine (Cys78) de sonsite actif. Grx1 réactive MerA en catalysant la réaction de déglutathionylation du site actif deMerA. Outre la tolérance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montré que Grx1 et MerAinterviennent également dans la résistance à l'uranium (CH3COO)2UO2.Parallèlement, j'ai analysé les interactions thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2. J'ai montré quela thiorédoxine réductase est capable de réduire Grx1, qui peut à son tour réduire Grx2. Cettevoie rédox originale compense l'absence de glutathion réductase chez Synechocystis. J'aiégalement montré que cette "nouvelle" voie rédox est capable de réduire le sélénate. Cesrésultats in vitro sont confortés par certains de mes résultats qui suggèrent que Synechocystisrépond au sélénate par la formation d'un hétérodimère Grx1-Grx2.Les deux "nouvelles" voies rédox caractérisées au cours de ma thèse sont particulièrementintéressantes car elles permettent de relier deux processus rédox, homéostasie rédox des thiolset détoxication des métaux lourds par réduction, qui n'étaient jusqu'ici pas considérés commeétant étroitement imbriqués