Réversion tumorale : étude fonctionnelle de TSAP6 et TCTP.

During my PhD I studied two genes, TSAP6 and TCTP that are differentially regulated in tumor reversion. The proteins encoded by these two genes interact and form a complex both in vitro and in vivo. My goal was to better understand the biological function of these two genes. Different approaches were used, namely crystallography (TCTP), knockout mice (TSAP6 and TCTP) and site-directed mutagenesis (TSAP6 and TCTP). The TSAP6 knockout mice display a microcytic anemia. We have shown that this anemia is due to a delay in the maturation of the reticulocytes and a default in the secretion of the Transferrin-Receptor by the exosomes. Since TSAP6 is a direct transcriptional target gene of p53, we analyzed the secretion of exosomes following activation of p53 by irradiation or Actinomicine D. We demonstrate that in the absence of TSAP6, there is no induction in the secretion of exosomes. More generally, we show that the TSAP6 gene has a major role in vivo in the secretion of exosomes, including following activation of p53. We studied the TCTP gene in its antiapoptotic role. The deletion of TCTP in knockout mice is lethal. This loss of TCTP causes an increase of apoptosis during embryogenesis. This embryonic lethality occurs between days 6,5 and 9,5 of the development. The crystal structure of TCTP at 2A resolution shows a strong homology with the one of s.pombe protein. Furthermore, we observed a homology between the H2-H3 helices of TCTP and the H5-H6 helices of BAX, a proapoptotic protein involved in mitochondrial membrane permeability. We demonstrated that these two helices are responsible for the antiapoptotic function of TCTP, which inhibits the dimerization of BAX in the mitochondrial membrane, preventing this way cell death.We also show that Sertraline and Thioridazine, that kill tumor cells by decreasing the level of intracellular TCTP, bind directly to TCTP and prevent the formation of a complex between TSAP6 and TCTP.Mon travail de doctorat a consisté en l'étude de deux gènes, TSAP6 et TCTP, qui sont régulés de manière différentielle dans la réversion tumorale. Les protéines encodées par ces deux gènes interagissent et forment un complexe tant in vitro que in vivo. Mon objectif était de mieux comprendre la fonction biologique de ces deux gènes. Différentes approches ont été employées, notamment la cristallographie (TCTP), souris knockout (TSAP6 et TCTP) et études par mutagénèse dirigée (TSAP6 et TCTP). Les souris knockout pour le gène tsap6 présentent une anémie microcytaire. Nous démontrons que cette anémie est due à un retard de maturation des réticulocytes ainsi qu'à une sécrétion défectueuse du récepteur à la Transferrine par les exosomes. Étant donné que le gène TSAP6 est une cible transcriptionnelle directe de la p53, nous avons voulu analyser la sécrétion des exosomes suite à une stimulation de p53 (par rayon X ou Actinomicine D). Nous montrons qu'en l'absence de TSAP6, on ne parvient pas à stimuler une sécrétion des exosomes. De manière plus générale ces expériences ont démontré que le gène TSAP6 avait in vivo un rôle prédominant dans la sécrétion des exosomes, y compris suite à l'activation de la p53. Nous avons surtout étudié le rôle que joue TCTP dans l'apoptose. La délétion du gène tctp dans les souris knockout est létale en provoquant une augmentation de l'apoptose au cours de l'embryogenèse. Cette mort embryonnaire se produit entre les 6,5ème et 9,5ème jours du développement. La détermination de la structure de la protéine TCTP par cristallographie avec une résolution de 2A montre que la protéine humaine est très homologue à celle de s.pombe. De plus, nous avons observé suite à une analyse informatique une homologie de structure entre les hélices H2 et H3 de TCTP et les hélices H5 et H6 de BAX, une protéine pro-apoptotique impliquée dans la perméabilité de la membrane mitochondriale. On a démontré que grâce à ces deux hélices, TCTP effectue son action anti-apoptotique et inhibe la dimérisation de BAX à la membrane des mitochondries, empêchant ainsi l'apoptose.Nous montrons également que la Sertraline et la Thioridazine, qui induisent la mort des cellules tumorales et une baisse concomitante de TCTP, se lient directement à TCTP et empêchent ainsi la formation du complexe TSAP6-TCTP