VECTORISATION NON-VIRALE DE MOLECULES THERAPEUTIQUES POUR LA THERAPIE DES CANCERS DU POUMON

Current cancer gene therapy protocols are strongly limited by several factors such as the low transduction efficiency, transient gene expression, or toxicity of the vector. To approach these problems, my work was concentrated on the non-viral delivery of biological molecules for the treatment of lung cancer with 3 main aspects:1/ Study of the antitumoral effect mediated by several viral fusogenic membrane glycoproteins (FMG) gene transfer. 2/ Vectorization of siRNAs in vivo by the cationic polymer : polyethylenimine (PEI).3/ Long-term expression of the transgene in vivo by non-viral delivery of the DNA vector containing Sleeping-Beauty (SB) transposon. Our results showed that : 1/ The FMG-based gene therapy was found to produce a highly efficient antitumor effect toward human lung cancer cells in vitro and in vivo. FMG expression is known to a/ induce the fusion of a single transfected cell to multiple neighboring untransfected cells, leading to the formation of large syncytia committed to death in 5 days b/ to induce a specific antitumor T-cell immunity in the host, through the release of immunogenic vesicles during the death of the syncytia. These 2 properties are cumulative and participate in the very strong bystander effect related to the use of FMG. Using FMGs of different origins (GALV, HERVW and RD) in vitro, we showed that the transfection of ~1% cells led to the death of up to 80% of the cultured cells. In vivo, treatment of human xenografts of lung cancer in nude mice by direct repeated intratumoral injections of the naked plasmids encoding these FMG showed a 60-70% reduction in tumor weight. This antitumor effect is thus very strong, especially in regard to the very poor efficiency of the transfection method (≤1% tumor cells are transfected). Furthermore, these results were obtained in immunodeficient mice. It is thus reasonable to assume that this FMG-based cancer therapy will be even more interesting in an immuno-competent animal. This study is currently going on in the laboratory. 2/ In vivo delivery of several formulations of PEI/siRNA polyplexes using the intravenous, intraperitoneal or subcutaneous administration routes showed partially positive, but usually transient and weak silencing effects against target genes (reporter gene or oncogene) in mouse lung or tumor xenografts. These results combined to the studies that we performed to measure the biodistribution of these complexes using in vivo fluorescent imaging, confirmed that the PEI is not as adapted for the delivery of siRNA as it is for plasmids. This suggests that additional chemical modifications of the PEI or siRNA would be necessary to augment the stability of these complexes in vivo. 3/ The systemic administration in the tail vein of nude mice of PEI-complexed plasmids containing a luciferase reporter gene inserted in SB transposon showed that a strong luciferase expression can be detected in the lung of mice for more than 4 months. As usual, the luciferase signal was very strong 1 day after transfection in the lung but rapidly disappeared in the following 2 weeks. However, because of the presence of the SB transposon, this signal was then progressively restored in the lung of these animals and reached a plateau 2 months after transfection. At this step the intensity of the luciferase signal was stable and represented around 15% of its maximum value measured at day 1. This pattern suggested that a stable transfection of the SB transposon into a small population of cells capable of lung regeneration was obtained. This result is promising and provides a platform for the delivery of active genes, such as CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene for therapeutic purposes, or the K-Ras gene for studying the Ras-dependant oncogenesis of lung cancer. It is thus of great importance to further characterize the nature of the stably transfected cells, and this will open a new field of investigation in the laboratory.L'utilisation de la thérapie génique du cancer est limitée actuellement par la faible efficacité de transfection, la durée d'expression du gène et la toxicité des vecteurs. Ces difficultés ont guidé l'orientation de mes travaux dans 3 directions:1/ Utilisation de gènes codant pour des glycoprotéines fusogeniques (FMG) comme gènes suicides à fort effet bystander. 2/ La vectorisation de siRNA in vivo par le vecteur polycationiques : polyethylenimine (PEI).3/ La stabilisation de l'expression du transgène à long terme in vivo à l'aide du transposon Sleeping Beauty (SB). Les résultats de ces travaux montrent que : 1/ La thérapie génique basée sur l'utilisation de FMG montre un fort intérêt thérapeutique sur des cellules de cancer du poumon humain in vitro et in vivo. En effet, ces protéines FMG ont i/ un fort effet cytotoxique qui passe essentiellement par la fusion entre la cellule transfectée et de nombreuses cellules voisines non-transfectées, ii/ la capacité d'induire une immunité antitumorale induite par la libération des vésicules immunogènes au cours de la mort des cellules fusionnées. Trois FMG ont été testées: GALV, HERV-W et RD. Dans les 3 cas nous avons montré que la transfection de ~1% des cellules in vitro conduit à la formation de large syncytia et à la mort de 25 à 80% des cellules en culture en moins de 5 jours. Le traitement des tumeurs sous-cutanées implantées chez des souris nudes induit une réduction du poids des tumeurs pouvant aller jusqu'à 70% alors que l'efficacité de transfection par injection directe des plasmides dans la tumeur est extrêmement faible (≤1%). Ces résultats démontrent que ces protéines FMG possèdent un potentiel intéressant pour la thérapie génique du cancer. Néanmoins, notre modèle de souris immunodéficient ne nous a pas permis de mesurer l'impact supplémentaire que nous pouvions attendre de la stimulation de la réponse antitumorale activée par la production de syncytiosomes. Cette étude est encore en cours. 2/ La vectorisation de polyplexes PEI/siRNA in vivo par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutané avec différentes formulations a montré des résultats faiblement positifs au mieux et souvent peu reproductibles. Nous avons étudié la biodistribution en temps réel de ces complexes en imagerie de fluorescence et mesuré leur capacité à inhiber l'expression d'un gène reporter ou d'un oncogène dans les poumons et/ou les tumeurs des souris. Globalement ces résultats démontrent que le PEI n'est pas un vecteur efficace pour les siRNA dans une approche systémique et que des modifications chimiques sur le PEI et/ou les siRNA devront être envisagées pour augmenter la stabilité et la performance de ces particules. 3/ L'insertion du transposon SB dans le plasmide vectorisé, complexé à du PEI et injecté en intraveineux, permet de stabiliser l'expression du transgène pendant plus de 4 mois dans les poumons. La mesure en cinétique à long terme du gène reporter dans les poumons montre en effet une forte expression du gène reporter codant pour la luciférase 1 jour après la transfection. Cette expression disparaît rapidement durant les 2 semaines suivantes jusqu'à devenir indétectable. De façon intéressante, le signal luciférase se rétablit ensuite progressivement pour atteindre un plateau 2 mois après la transfection. Le niveau d'intensité du signal de luciférase est alors d'environ 15% de celui mesuré le premier jour. Ces résultats suggèrent que le tansposon SB permet une insertion stable du transgène dans un nombre très restreint de cellules pulmonaires ayant la capacité de se multiplier. Ce résultat est prometteur et offrira une plate-forme d'intérêt qui permettra de vectoriser des gènes codant pour des protéines biologiquement actives, telles que celle codée par le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) pour la thérapie de la mucoviscidose, ou le gène K-Ras pour l'analyse de l'oncogenèse ras-dépendante dans le cancer du poumon. Enfin, les cellules touchées par l'insertion stable du transposon ayant un pouvoir de régénération du poumon important, il semble que nous ayons un moyen de modifier génétiquement des cellules souches pulmonaires. Nous souhaitons donc maintenant les caractériser précisément car cela ouvre des perspectives thérapeutiques importantes