Etudes structurales de différents processus biologiques impliquant les ARN de transfert

During this thesis, we have studied several biological processes involving transfert RNA. First, the study of the role of the nucleocapsid protein (NC) in the formation of the HIV-1 reverse transcription initiation complex enabled us to identify a strong and specific binding site for the NC onto the D-arm of tRNALys3 — the tRNA used as a primer by the reverse transcriptase for the cDNA(-) synthesis. This strong binding allows the melting of tertiary interactions between the T and D-arms of tRNALys3 and could also be a key factor driving the tRNALys3/viral RNA hybrid formation. The NMR structural study of the NC/D-arm complex encountered chemical exchange problems in the range intermediate–fast of the chemical shift time-scale. The use of CPMG-like sequences improved signal/noise ratio, particularly for signals belonging to the residues involved in the interface. This allowed us to identify NC residues involved in the D-arm recognition. Secondly, the structure the m1A58 methyltransferase of T. thermophilus (TrmI) — a tRNA modification enzyme — was solved by cristallography and refined to 1.7 Å. Three residues potentially involved into catalysis and/or tRNA substrat recognition were identified (D170, Y78 et Y194). The production of TrmI variants affected at these positions together with the molecular docking of an adenine into the TrmI active site enabled us to confirm this hypothesis and to propose a catalytic role for each mutated residue. In addition, non-denaturating gel electrophoresis and non covalent mass-spectrometry revealed the 1/2 stoichiometry of the TrmI tetramer/tRNA complex. Thirdly, the resolution of the E. coli initiator tRNAfMet structure uncovered a unique conformation of the anticodon region. This unique conformation is associated with the GC pairs within the anticodon stem, which are characteristic of initiator tRNA. This peculiar structure — in which the A37 base is not stacked between bases 36 and 38, as in all elongator tRNA structures — put in light many biochemical results of the literature and suggests a mechanism by which the translation initiation machinery could discriminate the initiator tRNA from all other tRNA.Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliquant les ARN de transfert. Premièrement, dans le cadre de l'étude du rôle de la protéine de nucléocapside (NC) dans la formation du complexe d'initiation de la transcription inverse du VIH-1, un site de fixation fort et spécifique de la NC a été identifié sur le bras D de l'ARNtLys3 — l'ARNt servant d'amorce à la transcriptase inverse lors de la synthèse du brin d'ADNc(-). Cette fixation permet d'une part la fusion des interactions tertiaires entre les bras T et D de l'ARNtLys3 et pourrait d'autre part être l'un des facteurs déplaçant l'équilibre vers la formation de l'hybride ARNtLys3/ARN viral. L'étude structurale par RMN du complexe NC/bras D s'est heurtée à des problèmes d'échange chimique dans la gamme intermédiaire–rapide de l'échelle de temps spectrale. L'utilisation de séquences de type CPMG–HSQC a permis d'améliorer le rapport signal/bruit des expériences RMN, et particulièrement celui des signaux des résidus de l'interface. Ceci nous a permis d'identifier les résidus de la NC impliqués dans la reconnaissance du bras D. Deuxièmement, la structure de la m1A58 méthyltransférase de T. thermophilus (TrmI) — une enzyme de modification des ARNt — a été résolue par cristallographie et affinée à 1.7 Å. Ceci a permis d'identifier trois résidus potentiellement impliqués dans la catalyse et/ou la reconnaissance du substrat ARNt (D170, Y78 et Y194). La production de variants de TrmI au niveau de ces résidus ainsi que des études d'amarrage moléculaire d'une adénine au site actif ont permis de confirmer cette hypothèse et de proposer un rôle catalytique pour chacun d'eux. Parallèlement, des études par gel natif et par spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes ont montré une stoechiométrie 1/2 pour le complexe entre l'enzyme TrmI tétramérique et le substrat ARNt. Troisièmement, la résolution de la structure cristallographique de l'ARNtfMet initiateur d'E. coli a révélé une conformation unique de la région de l'anticodon. Cette conformation unique est associée au paires GC de la tige anticodon, caractéristiques des ARNt initiateurs. Cette conformation particulière — dans laquelle la base A37 ne vient pas s'empiler entre les bases 36 et 38, comme dans tous les ARNt élongateurs — permet de mettre en lumière de nombreux résultats biochimiques de la littérature et suggère un mécanisme par lequel la machinerie de l'initiation de la traduction pourrait discriminer l'ARNt initiateur de tous les ARNt cellulaires