Identification et caractérisation de ligands des quadruplexes de guanines: cibler les télomères et/ou la télomérase?

Guanine quadruplexes (G4) are non-canonical nucleic acids structures formed by guanine-rich DNA and RNA sequences. In vivo, such structures appear to be implicated in genome dynamics, and especially at telomeres. In the latter case, G4 folding at telomeres using ligands stabilizing these structures could limit the proliferation of cancer cells. During this thesis work, we developed a middle-throughput method allowing to test the effect of various molecules on the stabilization of the human telomeric G4. This method is based on thermal dissociation of G4 followed by FRET, in the presence of several DNA competitive structures. It allowed us to identify some series of ligands displaying interesting affinity and selectivity for G4-DNA, such as neomycin-capped macrocycles and N-methylbisquinolinium phenanthrolin derivatives. We then characterized more thoroughly the molecular mechanisms by which these ligands could stabilize G4 structures. A kinetic study using a model of tetramolecular G4 showed that some peculiar G4 ligand families were able to strongly increase the association rate of the G4. We also analyzed telomerase inhibition in presence of these ligands. Using a direct primer extension assay, we highlighted that only few ligands were able to interfere with the telomerase processive elongation on a DNA substrate which did not form an intramolecular G4 initially. These results contributes to the already growing suspicion that cellular effects of these ligands are not solely related to their effect on telomerase, but should also result from their effect on other telomeric proteins essential to maintain of functional telomeres. Finally, we investigated the possibility to transpose the strategy of targeting telomeres with G4 ligands to limit cellular proliferation, to the pathogen organism responsible for Malaria : Plasmodium falciparum. We showed the existence of a 3' telomeric overhang in the parasite an its potential folding into a G4 structure under physiological conditions. We identified several molecules stabilizing the parasite telomeric G4 with a good selectivity versus duplex DNA, and we tested these drugs on the parasite proliferation.Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canoniques d'acides nucléiques formées par des séquences d'ADN ou d'ARN contenant des blocs de guanines. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus cellulaires, en particulier au niveau des télomères. Dans ce dernier cas, la formation de G4 aux télomères au moyen de ligands favorisant ces structures pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé une méthode de criblage à moyen débit permettant de tester l'effet de diverses molécules sur la stabilisation du G4 télomérique humain. Cette méthode, basée sur la dénaturation thermique de G4 suivie en fluorescence, en présence d'autres structures compétitrices d'ADN, a permis d'identifier plusieurs familles de ligands présentant des affinités et des sélectivités intéressantes, tels que des dérivés macrocycliques de néomycine et des N-méthylbisquinolinium phénanthrolines. Nous avons ensuite caractérisé plus précisément les mécanismes moléculaires expliquant la stabilisation des G4 par divers ligands. L'étude cinétique sur un modèle de G4 tétramoléculaire a permis de mettre en évidence la possibilité d'une accélération importante de la vitesse d'association des G4 par certaines familles de composés. Nous avons également analysé l'inhibition de la télomérase en présence de ces ligands. En utilisant un test d'extension d'amorce par la télomérase, nous avons montré que seuls certains ligands étaient capables d'enrayer l'élongation par la télomérase sur un substrat ne formant pas initialement de G4 intramoléculaire. Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle les effets cellulaires de ces ligands ne sont pas uniquement corrélés à leur effet sur la télomérase, mais aussi à des effets connexes impliquant d'autres protéines télomériques, essentielles au maintien de télomères fonctionnels. Enfin, nous avons transposé cette stratégie de ciblage du télomère pour limiter la prolifération cellulaire, à l'agent pathogène responsable de la Malaria : Plasmodium falciparum. Nous avons montré l'existence d'une extrémité télomérique 3' sortante chez le parasite et son potentiel repliement en G4 dans des conditions physiologiques. Plusieurs molécules stabilisant les G4 télomériques du parasite avec une bonne sélectivité ont été identifiées, et leur impact sur sa prolifération a été testé