Conséquence physiologiques et mécanistiques de l'intéraction covalente du facteur Rm3 avec l'ARN polymérase I chez la levure Saccharomyces cerevisiae

In Eukaryotes, the task of transcribing nuclear genes is shared between three DNA dependant RNA polymerases : RNA polymerase I II and III (Pol I, II and III), each of them transcribing a distinct set of genes. Pol I is dedicated to the synthesis of the large ribosomal RNA genes, and its activity monopolizes nearly 60% of the global transcriptional activity in rapidly growing yeast cells. Nuclear transcription is downregulated in many conditions and mostly during nutrient starvation which can be mimicked by rapamycin treatment. We constructed a yeast strain expressing a constituvely active form of Pol I (CARA strain). Using this strain, it has been demonstrated that Pol I activity contols the level of ribosome biogenesis. In this strain, the repression of Pol I activity is attenuated under rapamycin treatment comparing to the WT strain, but after 4 hours of treatment, the level of Pol I activity is nearly undectable in both strains. Surprisingly, in these conditions, the nucleolar structure in the CARA strain remained intact whereas the nucleolar structure falls apart in the WT strain. ChIP and Miller spread experiments revealed that even after 4 hours of rapamycin treatment, Pol I remained on the rDNA in CARA cells while we obsereved a drastic decrease of rDNA occupation by Pol I in WT cells. These results demonstrate for the first time that Pol I activity and nucleolar structure are uncoupled. We also investigated the mechanics of pol I transcription in vitro in order to determine the consequences of the non dissociability of the Pol I-Rrn3 complex. Our results suggest a model in which PolI-Rrn3 complex dissociates very rapidly shortly after or during initiation , this dissociation being a prerequisite for proper transcription elongation.Chez les Eucaryotes, la transcription du génome nucléaire est assurée par trois formes d'ARN polymérase ADN dépendantes (Pol I, II et III) qui transcrivent chacune une classe spécifique de gènes. Ainsi, la Pol I transcrit uniquement le gène codant le précurseur des grands ARN ribosomiques. La transcription Pol I est extrêmement active et représente plus de 60% de l'activité transcriptionnelle totale de la cellule en phase exponentielle de croissance. La transcription nucléaire dans sa globalité est réprimée dans de nombreuses conditions, notamment lors d'une carence en nutriments (qui peut être mimée par un traitement à la rapamycine). Nous avons étudié chez la levure S. cerevisiae les effets de traitements longs à la rapamycine sur la transcription Pol I. Grâce à une souche mutante de levure (souche CARA) dans laquelle la Pol I est constitutivement active, nous avons montré que le niveau de transcription Pol I contrôle le niveau de biogenèse des ribosomes. En présence de rapamycine et pour des temps courts de traitement, la répression de la transcription Pol I est atténuée dans la souche CARA par rapport à la souche sauvage (WT). Cependant, au bout de 4h de traitement, le niveau de transcription devient non détectable dans les deux souches et, de façon remarquable, la structure du nucléole est conservée dans la souche CARA alors que le nucléole est totalement déstructuré dans la souche WT. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine et des analyses par Miller spread ont permis de montrer que même après 4h de traitement à la rapamycine, la Pol I reste associée à l'ADNr dans les cellules CARA, alors que dans les cellules WT, une très forte diminution de l'occupation de l'ADNr par la Pol I est observée dès quelques minutes de traitement. Ces données constituent la première demonstration d'un découplage entre l'activité de transcription Pol I et le maintien de l'intégrité de la structure du nucléole. Dans une deuxième partie nous avons initié l'étude mécanistique de la transcription Pol I in vitro afin de déterminer les conséquences sur les différentes étapes du cycle transcriptionnel de l'association covalente du facteur Rrn3 avec l'enzyme. La seule différence entre les cellules WT et CARA étant a priori que le complexe Pol I-Rrn3 n'est pas dissociable dans la souche CARA. Nos résultats suggèrent un modèle selon lequel le complexe Pol I-Rrn3 se dissocie très rapidement lors de l'étape d'initiation. Cette dissociation est une étape nécessaire pour que l'ADNr 35S soit transcrit efficacement