Stratégie de vectorisation d'acides nucléiques et de drogues anticancéreuses dans les cellules hépatiques en culture

Les travaux de cette thèse n'auraient pu être réalisés sans le concours de l'association de biogénétique et de transfusion sanguine Gaëtan Saleün de Brest, les comités bretons (22, 29, 35 et 56) de la Ligue contre le Cancer ainsi que le Rallye Forestier de l'Espoir de Loudéac.HepaRG hepatoma cells are bipotent progenitors capable of differentiating after reaching confluence into biliary and hepatocyte-like cells expressing a large set of liver-specific functions including key drug metabolism enzymes. This new cell system is a unique in vitro model to investigate molecular and cellular pathways involved in the process of differentiation from hepatic progenitors towards hepatocytes as well as various aspects of the hepatocyte cell cycle regulation. In addition, it provides an alternative to primary culture of normal human hepatocytes for applications in the field of toxicology and drug metabolism. These cells, however, only express small amounts of an important cytochrome P450, the CYP2E1, which limits their use for toxicological studies of drugs metabolized by this pathway. Our aim was to establish efficient transfection protocols to increase CYP2E1 expression in HepaRG cells. Efficient transfection protocols were established using electroporation and cationic lipids belonging to the lipophosphonate and lipophosphoramidate family compounds. These protocols allowed us to achieve transient enforced expression of active CYP2E1 in differentiated HepaRG cells opening new perspectives for drug metabolism and toxicity studies in CYP2E1 expressing HepaRG cells. Efficient transfection protocols were further used to study gene repression by transfecting siRNAs including for the down-regulation of the AhR transcription factor. We demonstrated that the AhR protein is at least in part responsible of the induction of the CYP1A1 and 1A2 following exposure to the heterocyclic aromatic amines PhIP and MeIQx. Then, using optimal electroporation conditions, we derived a new stable recombinant HepaRG cell line expressing high levels of a hepcidine-GFP fusion protein, which constitute a novel cell model to investigate the metabolic pathways involved in the maturation and secretion of the hepcidine protein, a key hormonal regulator of iron metabolism. Finally, we initiated a new study to evaluate the relevance of novel nanoparticles synthesized using poly-malic acid for carrying anticancer drugs to target hepatocellular carcinomas. In a first step, we have studied the in vitro toxicity of these nanovectors using several cell lines then we evaluated the level of encapsulation of the doxorubicin as a standard molecule.Les cellules de la lignée d'hépatome HepaRG sont des progéniteurs bipotents capables de se différencier à confluence en cellules biliaires et en hépatocytes exprimant un large éventail de fonctions spécifiques du foie notamment plusieurs enzymes clés de détoxication. Ce système cellulaire constitue un modèle unique pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant le processus de différenciation du progéniteur hépatique vers l'hépatocyte ou encore certains aspects de régulation du cycle cellulaire de l'hépatocyte. Par ailleurs, il offre un modèle cellulaire alternatif aux cultures primaires d'hépatocytes humains pour des applications en pharmacotoxicologie. Cependant, ces cellules expriment un niveau relativement limité d'un important cytochrome P450, le CYP2E1, restreignant leur utilisation pour les études de toxicologie des drogues métabolisées par cette voie. Nous avions comme objectif d'établir des protocoles efficaces de transfection afin d'augmenter l'expression du CYP2E1 dans les cellules HepaRG. Des protocoles de transfection efficaces ont été établis en utilisant l'électroporation et des lipides cationiques appartenant aux lipophosphonates et lipophosphoramidates. Ces approches nous ont permis d'augmenter significativement le niveau d'expression et d'activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG différenciées ouvrant de nouvelles perspectives pour des études de métabolisme et de toxicité des drogues dépendantes du CYP2E1. La mise au point de ces protocoles de transfection a été mise à profit pour aborder d'autres applications notamment la répression par siARN de l'expression du récepteur aux amines aromatiques hétérocycliques AhR. Nous avons pu par électroporation dans des cellules HepaRG différenciées démontrer que AhR est au moins en partie responsable de l'induction des CYP1A1 et 1A2 par les amines aromatiques hétérocycliques PhIP et MeIQx. Toujours en utilisant un protocole d'électroporation, nous avons également établi une lignée HepaRG recombinante exprimant de façon constitutive l'hepcidine en fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP). Cette lignée constitue un nouvel outil d'étude du processus de maturation et de sécrétion de l'hepcidine un régulateur hormonal central du métabolisme du fer. Enfin, dans une dernière partie du travail, nous avons abordé un nouveau type de vectorisation : des nanoparticules synthétisées à partir de poly-acide malique dans le but d'encapsuler des principes actifs anticancéreux pour des applications potentielles dans le ciblage du carcinome hépatocellulaire. Une première étape a consisté à étudier la toxicité in vitro de ces particules sur plusieurs lignées cellulaires puis d'évaluer leur potentiel d'encapsulation de principe actif en utilisant la doxorubicine comme molécule de référence