Conception et élaboration de biopuces à oligosaccharides.

No abstractLa glycomique est la science qui s’intéresse à l’étude structurelle et fonctionnelle des saccharides,également appelés hydrates de carbone (ou carbohydrates). Les saccharides (aussi appelés glycanes dans ce cas) sont impliqués dans un très grand nombre d’évènements biologiques « normaux » et/ou pathologiques. Les relations entre la structure du saccharide et ses fonctions biologiques sont étudiées à l’aide de techniques conventionnelles telles que la cristallographie, la RMN, l’ITC, la plasmonique de surface. Ces études sont longues et couteuses et restent souvent limitées du fait de la très grande diversité des structures saccharidiques et de la difficulté à obtenir des saccharides pures en quantité importante.Pour pallier ces difficultés, nous proposons d’adapter la technologie biopuce qui permet d’effectuer un nombre très élevé d’études en parallèle (High Throughput Screening) avec des quantités réduites de matériels biologiques ou biochimiques.Cette thèse vise donc le développement de puces à sucres (ou glycoarray, carbohydrate array) avec deux principales innovations : 1) l’utilisation comme sondes de glycomimétiques qui miment les hydrates de carbone naturels mais dont la synthèse est plus aisée ; 2) l’immobilisation des sondes glycomimétiquessur la puce via l’hybridation d’ADN.La synthèse à façon des glycomimétiques permet d’obtenir des sondes de structures et de naturechimique diverses et offre la possibilité d’ajouter pour chaque type de sondes une étiquette ADN pour d’une part immobiliser les glycomimétiques de manière orientée sur la puce par DDI (DNA DirectedImmobilisation) et d’autre part localiser et identifier les glycomimétiques sur la puce. Ces glycomimétiques ont été synthétisés par l’Institut des Biomolécules Max Mousseron de Montpellier en collaboration avec l’Institut de Chimie et Biochimie Moléculaire et Supramoléculaire de Lyon.Une première partie de ce travail a été de valider l’élaboration des puces à sucre puis d’augmenter les capacités d’analyses des glycoarrays basés sur la DDI. Pour cela l’efficacité de l’immobilisation par DDIa été comparée à une immobilisation covalente. Nos résultats ont montré une reconnaissance supérieure par la lectine RCA 120 de glycomimétiques immobilisés par DDI aux faibles concentrations englycomimétiques. La miniaturisation de la puce a consisté à graver 40 microréacteurs sur un format lame de microscope. Chaque microréacteur formant une puce de 64 plots différents, on peut ainsi réaliser 40expériences indépendantes. Grâce à ce type de glycoarrays, des tests d’IC50 ont permis d’obtenir des données quantitatives de l’affinité des glycomimétiques/lectines en utilisant d’infimes quantités de matériels biologiques. D’autre part, nous avons démontré la possibilité d’accélérer les études d’interactions sucres/lectines en poolant simultanément 8 glycomimétiques et 2 lectines.La deuxième partie de la thèse a été d’utiliser les glycoarrays pour étudier les paramètres structuraux(distribution spatiale, nature chimique de la molécule, charge…) permettant d’exacerber l’affinitélectines/glycomimétiques. Trois lectines ont été étudiées : RCA120 (lectine modèle d’origine végétale) et deux lectines PA-IL et PA-IIL facteurs de virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Trois typesd’architectures de glycomimétiques (en peigne, en antenne et en couronne) ainsi que l’effet de la charge portée (+, -, neutre) ont été étudiés. L’architecture en peigne a clairement montré une affinité supérieure vis-à-vis des 2 lectines (PA-IL et PA-IIL) et PA-IL marque une préférence pour les structures chargées positivement. Soulignons que les interactions monovalentes sucres/lectines sont souvent faibles (mM). [...