Facteurs modulant la radiosensibilité : rôle des protéines PARP-1, PARP-2 et Cdk5 et implication de la chromatine

The post-translational modifications of DNA repair proteins and histone remodeling factors by poly(ADP-ribose)ylation and phosphorylation are essential for the maintenance of DNA integrity and chromatin structure, and in particular in response to DNA damaging produced by ionizing radiation (IR). Amongst the proteins implicated in these two processes are the poly(ADP-ribose) polymerase -1 (PARP-1) and PARP-2, and the cyclin-dependent kinase Cdk5: PARP-1 and 2 are involved in DNA single strand break (SSB) repair (SSBR) and Cdk5 depletion has been linked with increased cell sensitivity to PARP inhibition. We have shown by using HeLa cells stably depleted for either CdK5 or PARP-2, that the recruitment profile of PARP-1 and XRCC-1, two proteins involved in the short-patch (SP) SSBR sub-pathway, to DNA damage sites is sub-maximal and that of PCNA, a protein involved in the long-patch (LP) repair pathway, is increased in the absence of Cdk5 and decreased in the absence of PARP-2 suggesting that both Cdk5 and PARP-2 are involved in both SSBR sub-pathways.PARP-2 and Cdk5 also impact on the poly(ADP-ribose) levels in cells as in the absence of Cdk5 a hyper-activation of PARP-1 was found and in the absence of PARP-2 a reduction in poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) activity was seen. However, in spite of these changes no impact on the repair of SSBs induced by IR was seen in either the Cdk5 or PARP-2 depleted cells (Cdk5KD or PARP-2KD cells) but, interestingly, increased radiation sensitivity in terms of cell killing was noted in the Cdk5 depleted cells. We also found that Cdk5, PARP-2 and PARG were all implicated in the regulation ofthe recruitment and the dissociation of the chromatin-remodeling factor ALC1 from DNA damage sites suggesting a role for these three proteins in changes in chromatin structure after DNA photodamage.These results, taken together with the observation that PARP-1 recruitment is sub-optimal in both Cdk5KD and PARP-2KD cells, show that an intricate network of phosphorylation and poly(ADPribose) ylation occurs in response to IR that involves Cdk5 , PARP-1,PARP-2 and PARG and that is probably initiated by Cdk5’s kinase activity.Les modifications post-traductionnelles des protéines de réparation de l’ADN et des facteurs chromatiniens par poly(ADP-ribose)ylation et par phosphorylation sont essentielles pour le maintien de l’intégrité de l’ADN et de la chromatine, en particulier dans la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN induits par radiation ionisantes (RI). Parmi les protéines impliquées dans ces deux processus nous trouvons, respectivement, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) et PARP-2, et la kinase dépendante des cyclines Cdk5 : PARP-1 et PARP-2 sont impliqué dans le mécanisme de réparationdes cassures simples brin (CSBs) de l’ADN (Single Strand Break Repair : SSBR ) et la déplétion de Cdk5 a été liée à l’augmentation de la sensibilité des cellules aux inhibiteurs de PARPs. Nous avons montré, en utilisant des cellules HeLa stablement déplété pour Cdk5 ou PARP-2, que ces deux protéines sont impliquées dans les deux sous-voies du SSBR, le short- (SPR) et le long-patch repair (LPR). L’absence de Cdk5 ou PARP-2 entraîne des modifications du fonctionnement du SSBR, notamment en termes de recrutement des protéines de réparation PARP-1 et XRCC1, impliquées dans le SPR, et PCNA, protéine clé du LPR, au site du photo-dommage. PARP-2 et Cdk5 agissent aussi sur la balance du niveau des poly(ADP-ribose) car en absence de Cdk5 une hyper-activation de PARP-1 a été montrée, et en absence de PARP-2 une diminution de l’activité de la protéine poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) a été aussi observée. Cependant, malgré ces changements les deux lignées cellulaires dépourvues de Cdk5 (Cdk5KD) ou de PARP-2 (PARP-2KD) réparent de façon normale les CSBs radio-induites, mais, intéressement et contrairement aux cellules PARP-2KD, les cellules Cdk5KDsont sensibles à l’effet létal des RI. De plus nous avons montré que Cdk5, PARP-2 et PARG sont toutes les trois impliquées dans la régulation du recrutement et de dissociation du facteur chromatinien ALC1 suggérant leur implication dans la régulation de la dynamique de la chromatine en réponse aux photo-dommages de l’ADN. Ces résultats avec l’observation de la diminution du recrutement de PARP-1 dans les cellules Cdk5KD et PARP-2KD, montrent l’apparition d’un réseau complexe de phosphorylation et de poly(ADP-ribose)ylation en réponse aux RI qui implique Cdk5 , PARP-1,PARP-2 and PARG et qui est fort probablement initié par l’activité kinase de Cdk5