RECEPTEURS NICOTINIQUES NEURONAUX D'INSECTES ET INSECTICIDES : CARACTERISATION DE FACTEURS CELLULAIRES IMPLIQUES DANS LA MODULATION DE L'EFFICACITE DES NEONICOTINOÏDES

Plant protection products are essential to increase crops quality. However, European and national directives advocate a reduction of their use from 50% with the aim to protect the environment and to limit effect on non-targeted organisms. In this perspective, in order to optimize the efficacy of these products while reducing their dose of use, it is necessary to characterize cellular and intracellular factors which are involved in the modulation of insecticide effect on their membrane target. Among the insecticides most use in crop protection, neonicotinoids rank as one of the most important class in the market. They act on insect nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) from insect central nervous system. From the cockroach Periplaneta americana, neurosecretory cells, identified as Dorsal Unpaired Median (DUM) neurons, express two subtypes of nAChRs (nAChR1 and nAChR2). Whereas nAChR1 is sensitive to imidacloprid (IMI), a first generation of neonicotinoid, this insecticide has no effect on nAChR2. In order to acquire a better understanding of the mode of action of these insecticides on insensitive nAChRs, the aim of this work was to characterize, from an electro-pharmacological point of view, the cellular and molecular factors which influence the efficacy of a second generation neonicotinoid, acetamiprid (ACT) which present a different chemical structure from IMI. Using the patch-clamp technique, under voltage-clamp mode, it was demonstrated that the effect of ACT on nAChR2 is dependent on transmembrane potential. A membrane depolarization slightly increases nAChR2 sensitivity to ACT whereas a hypepolarisation induces an opposite effect. In these two cases, an involvement of intracellular calcium was demonstrated. For potential more positive than the membrane potential (i.e. -50 mV), the inhibition of calcium influx via high-voltage activated (HVA) channels by cadmium chloride and ω-conotoxine GVIA increases the nAChR2 sensitivity to ACT. Similar effects are obtained for membrane potential more hyperpolarized when calcium permeability is inhibited by LOE 908, a specific inhibitor of TRPγ channels. In this case, the use of specific pharmacological tools (forskoline, W7) allowed to reveal the implication of the signaling pathway of cyclicAMP/adenylyl cyclase in the modulation of ACT efficacy on nAChR2. Finally, measurements of membrane resistance, realized at the same time in current-clamp mode, indicate that the conformational state of nAChR2 has an important role in the modulation of nAChR2 sensitivity to ACT. All of results which allowed to identify new cellular and molecular factors involved in the modulation of nAChR2 sensitivity to the neonicotinoid, ACT, open new interesting perspectives in order to optimize the efficacy of insecticide treatment.L'utilisation des produits phytosanitaires est indispensable pour augmenter la qualité des productions agricoles. Cependant les directives européennes et nationales préconisent une réduction de 50 % de leur utilisation pour préserver l'environnement et limiter les effets secondaires sur les organismes non-cibles. Dans cette optique, et pour optimiser l'efficacité de ces produits tout en diminuant leur dose d'utilisation, il est nécessaire de caractériser les facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'effet insecticide de ces composés sur leurs cibles membranaires. Parmi les insecticides les plus utilisés en agriculture, les néonicotinoïdes occupent une place importante sur le marché. Ils ont pour cible les récepteurs à l'acétylcholine de type nicotinique (nAChRs) du système nerveux central des insectes. Chez la blatte Periplaneta americana, des cellules neurosecrétrices identifiées, les neurones DUM, expriment deux sous-types de nAChRs, (nAChR1 et nAChR2). Alors que nAChR1 est sensible à l'imidaclopride (IMI), néonicotinoïde de première génération, cet insecticide ne présente aucun effet sur nAChR2. Afin d'obtenir une meilleure compréhension du mode d'action de ces insecticides sur des nAChRs insensibles, l'objectif de ce travail de recherche a été de caractériser du point de vue électro-pharmacologique les facteurs cellulaires et moléculaires qui influencent l'efficacité d'un insecticide néonicotinoïde de seconde génération, l'acétamipride (ACT) qui présente des caractéristiques chimiques différentes de l'IMI. Grâce à la technique électrophysiologique du patch-clamp, dans des conditions de potentiel imposé, il a été possible de démontrer que l'effet de l'ACT sur nAChR2 dépend du potentiel de membrane. Une dépolarisation de la membrane augmente légèrement la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT alors qu'une hyperpolarisation produit un effet inverse significatif. Dans les deux cas, l'implication du calcium intracellulaire a été démontrée. Pour des potentiels plus positifs que le potentiel de membrane (i.e., -50 mV), l'inhibition de l'influx calcique via l'activation des canaux calciques à haut seuil d'activation (High Voltage- Activated) par le chlorure de cadmium et l'ω-conotoxine GVIA augmente la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT. Des effets similaires sont obtenus pour des potentiels de membrane plus hyperpolarisés lorsque la perméabilité calcique est inhibée par le LOE 908, un inhibiteur des canaux TRPγ. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'outils pharmacologiques spécifiques (e.g., forskoline, W7) a permis de révéler que la voie de signalisation intracellulaire AMPcyclique/adenylate cyclase est impliquée dans la modulation de l'efficacité de l'ACT sur nAChR2. Enfin, des mesures de la résistance membranaire, réalisées en parallèle dans des conditions de courant imposé, indiquent que l'état conformationnel des nAChR2 joue également un rôle important dans la modulation de l'efficacité de l'ACT. L'ensemble de ces résultats qui ont permis d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'efficacité d'un néonicotinoide, l'ACT ouvrent des perspectives très intéressantes pour optimiser l'efficacité d'un traitement insecticide