Etude du métabolisme des amines biogènes chez les bactéries lactiques du vin

Biogenic amines are indesirable compounds found in fermented products like wine. Lactic acid bacteria from wine, including Oenococcus oeni, the main actor of malolactic fermentation, are able to produce these molecules from nitrogenous precursors. In order to limited biogenic amines accumulation, it is necessary to understand the role of this production by strains responsible for the synthesis of these metabolites in food. That is why the European BiamFood project was put in place. Along my thesis, molecular tools were developed in order to mutate O. oeni genes (encoding decarboxylases), and to express genes of interest. Genetic clusters hdc from L. higardii and odc from O. oeni, responsible for histamine and putrescine synthesis respectively, were cloned into the pGID052 vector and transferred into the laboratory strain O. oeni ATCC BAA-1163, which is not able to produce any biogenic amines. However no biogenic amines production was observed. My work thesis was then redirected in the in vitro biochemical characterization of the ODC from O. oeni. The odc from O. oeni BR14/97 was overproduced in E. coli BL21 via the pET system. Optima pH and temperature were determined with the purified enzyme obtained. Kinetic constants Km = 1 mM and Vmax = 0,57 U.mg-1 were also determined by measuring putrescine production by HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). Furthermore, ODC from O. oeni BR14/97 is specific for the L-ornithine and can not decarboxylated the L-lysine into cadaverine. In a second part of the BiamFood project, the impact of nitrogen sources, especially peptides compared to free amino acids, was studied in a Lactobacillus plantarum strain, isolated from wine and able to produce tyramine. Peptides containing tyrosine residues are used by this strain to produce tyramine. Tyramine production increases during the growth and reaches a maximum at stationary phase. The production is correlated with tyrP expression. The tyrosine measured in culture media shows that peptides may be hydrolyzed in the extracellular medium in L. plantarum.Les amines biogènes sont des composés allergènes, notamment rencontrés dans les produits fermentés tel que le vin. Les bactéries lactiques du vin, dont Oenococcus oeni, le principal acteur de la fermentation malolactique, sont capables de produire ces molécules, à partir de précurseurs azotés. Afin de réduire la teneur en amines biogènes, il est nécessaire de comprendre le rôle de cette production, chez les souches impliquées dans la synthèse de ces métabolites. Le projet européen BiamFood FP7 (n°211441) a été mis en place pour répondre à cette problématique. Au cours de mon travail de thèse, des outils moléculaires ont été développés afin de muter de manière ciblée les gènes de O. oeni et d’exprimer des gènes d’intérêt. Ainsi, les clusters hdc de Lactobacillus hilgardii et odc de O. oeni, responsables respectivement de la synthèse de l’histamine et de la putrescine, ont été clonés dans le vecteur pGID052 et transférés dans la souche de laboratoire O. oeni ATCC BAA-1163, déficiente pour la production d’amines biogènes. Cette stratégie n’ayant pas donnée lieu à la production d’amine biogène, mon travail de recherche s’est orienté vers la caractérisation biochimique de l’ornithine décarboxylase de O. oeni. L’ornithine décarboxylase de O. oeni BR14/97 a été sur-produite chez E. coli via le système pET. Après purification de l’enzyme, le pH optimal et la température optimale de fonctionnement, 5,5 et 35°C respectivement, ont été caractérisés. Les constantes cinétiques Km = 1 mM et Vmax = 0,57 U. mg-1 ont également été déterminées en mesurant la putrescine produite par HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). De plus, l’ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas dégrader la L-lysine en cadavérine, ce qui implique la présence d’une voie métabolique propre à la production de cadavérine chez cette souche. Dans un second axe du projet, l’influence de la source azotée et notamment des peptides versus acides aminés libres, a été étudiée chez une souche de Lactobacillus plantarum, isolée du vin et productrice de tyramine. Les peptides contenant de la tyrosine, sont utilisés par cette souche pour former de la tyramine. La production augmente en phase stationnaire de croissance, et est corrélée à l’expression du transporteur tyrP. L’analyse de la tyrosine présente dans le milieu de culture montre que ces peptides seraient dégradés dans le milieu extracellulaire chez L. plantarum