Maturation et trafic intracellulaire du transporteur biliaire ABCB4 : effet de mutations

The ABC transporter ABCB4 is a phosphatidylcholine translocator expressed at the bile canalicular membrane of hepatocytes. Variations of the ABCB4 gene have been recognized as causing progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3) in children, a rare lethal disorder which progresses to cirrhosis and liver failure before adulthood. We studied the effect of the I541F mutation described in a PFIC3 patient. In contrast to wild-type ABCB4 which was localized at the bile canalicular membrane in HepG2 cells and at the apical surface in MDCK cells after stable transfection, the I541F mutant did not fold properly and accumulated in the endoplasmic reticulum (ER). After shifting cells to 27°C, the mutant was expressed at the apical cell surface in a mature and active form. Modulation of the cellular chaperones calnexin and Hsc/Hsp70 did not restore intracellular trafficking of the mutant. Cyclosporin A improved maturation and plasma membrane expression of ABCB4-I541F, thus opening perspectives to develop novel therapies for the treatment of PFIC3. The second part of the study was aimed at identifying the role of the N-terminal cytoplasmic domain of ABCB4, which does not show homology with other ABC transporters. Progressive deletions of the N-terminus identified a positively charged sequence of 11 amino-acids, which is required for exit of the ER. Single point mutations (T34M and R47G) identified in patients did not affect processing and trafficking, but strongly decreased the function of ABCB4. These results show that the N-terminal domain is required for both trafficking and function of ABCB4ABCB4 est un transporteur ABC spécialisé dans la sécrétion de phosphatidylcholine au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. Des variations du gène ABCB4 sont responsables de la cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3), une maladie rare, létale, qui progresse en cirrhose et insuffisance hépatique avant l'âge adulte. Nous avons étudié l'effet de la mutation I541F décrite chez un patient. Contrairement à la forme sauvage d'ABCB4 localisée à la membrane des canalicules biliaires dans les cellules HepG2 et à la surface apicale dans les cellules MDCK transfectées, le mutant I541F n'est pas replié correctement et s'accumule dans le réticulum endoplasmique (RE). Après transfert à 27°C, le mutant est exprimé à la surface apicale sous forme mature et active. La modulation des chaperonnes cellulaires calnexine et Hsc/Hsp70 ne restaure pas le trafic intracellulaire du mutant. La cyclosporine A augmente la maturation et l'expression à la membrane plasmique d'ABCB4-I541F, ce qui ouvre des perspectives de développer de nouvelles thérapies pour le traitement de la PFIC3. La seconde partie du travail a eu pour objectif de déterminer le rôle du domaine cytoplasmique N-terminal d'ABCB4, qui n'a pas d'homologie avec d'autres transporteurs ABC. Des délétions progressives de ce domaine ont permis d'identifier une séquence de 11 acides aminés nécessaire à la sortie du RE. Des mutations ponctuelles (T34M et R47G) identifiées chez des patients n'affectent pas la maturation ni le trafic, mais diminuent fortement l'activité d'ABCB4. Ces résultats montrent que le domaine N-terminal est nécessaire à la fois pour le trafic et l'activité d'ABCB