Optimisation des thérapeutiques immunosuppressives par méthode pharmacologique.

Immunosuppressive drugs have proven efficacy in the prevention of acute rejection of solid organ transplantation. However, these drugs exhibit substantial variability in pharmacological response due to such a variation in their pharmacokinetics. This variability may be the cause of underexposure with a lack of efficacy or over-exposure causing toxicity. Therapeutic drug monitoring (TDM) of immunosuppressant blood levels can limit the risk of over or underexposure facilitating dosage adjustment of these treatments. Despite the extensive use of TDM, the incidence of acute rejection has declined somewhat in recent years and remains high (in the order of 8-15%). Acute cellular rejection can further occur in patients even though blood levels are within the therapeutic range. That is why improvements in the therapeutic monitoring and new ways of monitoring are relevant lines of investigation in pharmacology.The objective of this phD work was to develop new pharmacological tools for monitoring the effect of two immunosuppressive drugs, everolimus and tacrolimus in order to control the pharmacological variability of the immunosuppressive effect .For the first time, the pharmacokinetics of everolimus in heart transplant was modeled by a population approach. Pharmacological modeling is one of the current areas of improvement of immunosuppressants TDM which allows evaluating the impact of demographic, biological and / or genetic on the pharmacokinetics of these drugs covariates. The development of this model must allow individualization of dosages leading to limit pharmacokinetic variability during treatment with this drug.During this work, two analytical methods were also developed by LC-MS/MS for assaying intracellular tacrolimus and everolimus concentrations. Measuring intracellular concentrations of immunosuppressive drugs, i.e. at its site of action, appears as a more relevant than measuring blood concentrations. These methods were then evaluated on small cohorts of heart transplant patients. The feasibility of such assays has been demonstrated and led to the completion of the last part presented in this work.Indeed, a clinical study was performed in de novo liver transplant patients to evaluate blood and intracellular concentrations of tacrolimus and their effect on the target protein, calcineurin. For the first time complete intracellular pharmacokinetics have been obtained for the description of the profile of the intracellular kinetics of tacrolimus. This study also highlights and describes the relationship dose - blood concentration - intracellular concentration - effect on the target protein of tacrolimus in liver transplant patients. This work might help conducting clinical trials to assess the relevance of a longitudinal follow-up of intracellular concentrations and / or activity of calcineurin in the prevention of transplant rejection.The tools developed in this PhD work aimed, firstly, to better understand the variability of the pharmacological response in immunosuppressive therapy and, secondly, to be tools for understanding the drug mechanisms inside of the cell. The use of these tools should contribute to the decrease in the frequency of graft rejection and the overall improvement in the management of organ transplant patients.Les immunosuppresseurs sont des médicaments ayant démontré leur efficacité dans la prévention du rejet de transplantation d’organe solide. Néanmoins, ces médicaments présentent une importante variabilité de la réponse pharmacologique notamment liée à une variation de leur pharmacocinétique. Cette variabilité peut être à l’origine d’un défaut d’efficacité du traitement ou de sur-expositions entrainant une toxicité. Le suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des concentrations sanguines d’immunosuppresseur permet de limiter ces risques de sur ou de sous-exposition en facilitant l’adaptation de posologie de ces traitements. En dépit de l'utilisation intensive du STP des concentrations d'immunosuppresseurs chez le transplanté d'organe, la fréquence du rejet aigu a peu diminué au cours de ces dernières années et reste élevée. Le rejet aigu cellulaire peut, en outre, survenir chez le patient alors même que ses concentrations sanguines sont en zone thérapeutique. C'est pourquoi la recherche d'améliorations de ce suivi thérapeutique ainsi que la recherche de nouveaux moyens de monitoring sont des axes pertinents d'investigation en pharmacologie des immunosuppresseurs. L’objectif de ce travail de doctorat a été de développer de nouveaux outils pharmacologiques de monitoring de l’effet de deux immunosuppresseurs, l’évérolimus et le tacrolimus, dans le but de participer à la maitrise de la variabilité pharmacologique de l’effet immunosuppresseur. Pour la première fois, la pharmacocinétique de l'évérolimus chez le transplanté cardiaque a été modélisée par une approche de population. La modélisation pharmacologique est un des axes actuels d’amélioration du STP des immunosuppresseurs permettant d’évaluer l’impact de covariables démographiques, biologiques et/ou génétiques sur la pharmacocinétique de ces médicaments. L’élaboration de ce modèle doit permettre une individualisation des posologies conduisant à la limitation de la variabilité pharmacocinétique lors d’un traitement par cette molécule.Au cours de ce travail, deux méthodes analytiques ont également été développées par LC-MS/MS pour le dosage intracellulaire de l’évérolimus et du tacrolimus. La mesure des concentrations des immunosuppresseurs à l’intérieur même de la cellule, c’est à dire au niveau de son site d’action, apparait comme une mesure plus pertinente que la simple mesure des concentrations dans le sang. Ces méthodes ont ensuite été évaluées sur des petites cohortes de patients transplantés cardiaques. La faisabilité de tels dosages a été démontrée et a permis la réalisation de la dernière partie présentée au cours de ce travail. En effet, une étude clinique a été réalisée chez le patient transplanté hépatique de novo en vue de rapprocher les concentrations sanguines et intracellulaires de tacrolimus et l'effet sur la protéine cible, la calcineurine. Pour la première fois des pharmacocinétiques intracellulaires complètes ont pu être obtenues permettant la description de la cinétique intracellulaire du tacrolimus. Cette étude a également permis de mettre en évidence et de décrire la relation dose - concentration sanguine - concentration intracellulaire - effet sur la protéine cible du tacrolimus chez le transplanté hépatique. Ces travaux ont permis de jeter les bases nécessaires à la réalisation d'essais cliniques permettant d'évaluer la pertinence d'un suivi longitudinal des concentrations intracellulaires et/ou de l'activité de la calcineurine dans la prévention de rejet de transplantation. Les outils développés au cours de ce travail de doctorat visent, d’une part, à mieux appréhender la variabilité de la réponse pharmacologique au cours d’un traitement immunosuppresseur et, d’autre part, à être des outils de compréhension des mécanismes pharmacocinétiques et cellulaires de ces traitements. L'utilisation de ces outils doit concourir à la diminution de la fréquence du rejet de greffe et à l'amélioration globale de la prise en charge du patient transplanté d'organe