Utilisation du carbure de tungstène-cobalt (WC-Co) comme témoin positif génotoxique nanoparticulaire et étude de la génotoxicité de candidats nanovecteurs de médicaments

Nanomaterials are used in many industrial sectors, and many nanomaterial-containing consumer products are already available. In this context of increasing human exposure to nanomaterials, the evaluation of their genotoxicity is of significant importance. However, the relevance of routinely used genotoxicity assays, developed for non-nanoparticular products, is often questioned for the evaluation of nanomaterials. A nanoparticulate reference positive control would therefore constitute an important step to a better testing of nanomaterials genotoxicity, ensuring that test systems are actually appropriate and/or allowing the validation of new ones.Firstly, we studied the possibility of using commercially-available tungsten carbide-cobalt (WC-Co) nanoparticles, previously characterized for physicochemical properties (size distribution and charge in used media), as positive control in three in vitro genotoxicity assays. The mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay, the micronucleus assay studying chromosomal aberrations and the comet assay detecting primary DNA damage were performed. The last two assays were realized in two cell types, the mouse lymphoma cell line L5178Y and primary cultures of human lymphocytes. Our results show that WC-Co nanoparticles could be used as positive control in these in vitro genotoxicity assays, according to cell type and treatment schedule.Secondly, we investigated the mechanisms of action involved in WC-Co nanoparticles genotoxicity. Detection of centromeres in micronuclei using fluorescence in situ hybridization (FISH) show the involvement of both clastogenic and aneugenic activities. This was correlated with the results of a chromosome aberration assay on human lymphocytes blocked in metaphase, showing chromatid breaks and polyploid cells. Moreover, as oxidative mechanisms are the most described for nanomaterials, we studied oxidative DNA damage using the modified in vitro comet assay with the DNA repair enzyme formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG). We also detected a production of hydroxyl radicals using electron paramagnetic resonance in suspensions of WC-Co nanoparticles with and without cells. While performing high-throughput assays on WC-Co nanoparticles in three human cell lines corresponding to the main target organs for nanomaterials (A549 lung cell line, Hep3B liver cell line and Caki-1 kidney cell line) it was confirmed that oxidative stress play a significant role in the toxicity of WC-Co nanoparticles. Indeed, the production of reactive oxygen species in cells exposed to WC-Co nanoparticles was correlated to the observation of cytotoxicity and genotoxicity, studied using the detection of γH2AX foci.Finally, we carried out the most relevant genotoxicity assays to study nanodiamonds and lipid nanocapsules, which constitute promising nanovectors for drug delivery. The in vitro comet and micronucleus assays were performed on other cell types mimicking target organs: the T84 intestinal epithelial cell line and the 16-HBE bronchial epithelial cell line exposed to nanodiamonds of three different sizes, and human lymphocytes exposed to lipid nanocapsules of three different sizes and three different charges.Les nanomatériaux sont utilisés dans de nombreux secteurs industriels, et plusieurs produits de consommation contenant des nanomatériaux sont d’ores et déjà commercialisés. Dans ce contexte d’exposition humaine croissante aux nanomatériaux, l’évaluation de leur potentiel génotoxique est d’une importance significative. Cependant, la pertinence des tests classiques de génotoxicité, développés pour des produits non nanoparticulaires, est fréquemment remise en question pour l’évaluation des nanomatériaux. Un témoin positif de référence sous forme nanoparticulaire pourrait donc constituer une avancée importante pour l’évaluation de la génotoxicité des nanomatériaux, permettant de s’assurer que les systèmes d’essais sont appropriés et/ou d’en valider de nouveaux.Dans un premier temps, nous avons étudié la possibilité d’utiliser des nanoparticules de carbure de tungstène – cobalt (WC-Co) commerciales, préalablement caractérisées sur le plan physico-chimique (distribution de taille et charge dans les milieux utilisés), comme témoin positif dans trois essais de génotoxicité in vitro. Le test de mutations géniques au locus thymidine kinase sur cellules de lymphome de souris, le test des micronoyaux étudiant les dommages chromosomiques et le test des comètes détectant les dommages primaires à l’ADN ont ainsi été réalisés, les deux derniers essais dans deux types cellulaires, la lignée de lymphome de souris L5178Y et des cultures primaires de lymphocytes humains. Nos résultats montrent que les nanoparticules de WC-Co pourraient être utilisées comme témoin positif dans ces essais de génotoxicité in vitro, selon le type cellulaire et le schéma de traitement.Nous avons ensuite étudié les mécanismes d’action impliqués dans la génotoxicité des nanoparticules de WC-Co. Le marquage des centromères dans les micronoyaux grâce à la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) montre l’implication d’évènements clastogènes et aneugènes. Ces résultats ont été confirmés par un essai d’aberrations chromosomiques sur lymphocytes humains bloqués en métaphase, avec l’observation de cassures de chromatides et de cellules polyploïdes. Par ailleurs, les mécanismes oxydants étant les plus décrits pour les nanomatériaux, nous avons étudié les lésions oxydatives à l’ADN en utilisant le test des comètes in vitro modifié avec l’enzyme de réparation de l’ADN formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG). Nous avons également détecté par résonance paramagnétique électronique une production de radicaux hydroxyles après mise en suspension des nanoparticules de WC-Co en présence et en absence de cellules. Dans le cadre d’études haut-débit des nanoparticules de WC-Co réalisées dans trois lignées cellulaires humaines correspondant aux principaux organes cibles pour les nanomatériaux (la lignée pulmonaire A549, la lignée hépatique Hep3B et la lignée rénale Caki-1), il a été confirmé que le stress oxydant joue un rôle important dans la toxicité des nanoparticules de WC-Co. En effet, la production d’espèces réactives de l’oxygène dans les cellules traitées avec les nanoparticules de WC-Co était corrélée avec l’observation d’une cytotoxicité et de génotoxicité, étudiée à l’aide du test de détection des foyers γH2AX.Finalement, nous avons appliqué les tests de génotoxicité les plus pertinents à l’étude de nanodiamants et de nanocapsules lipidiques, qui constituent des candidats prometteurs pour la vectorisation de principes actifs. Les tests des comètes et des micronoyaux in vitro ont ainsi été réalisés sur d’autres types cellulaires mimant des organes cibles : la lignée intestinale T84 et la lignée bronchique 16-HBE exposées à des nanodiamants de trois tailles différentes et des lymphocytes humains exposés à des nanocapsules lipidiques de 3 tailles et 3 charges différentes