Microscopie multimodale non-linéaire résolue en polarisation pour l’étude des lipides: modèles membranes à la myéline dans les tissus.

Polarization resolved nonlinear microscopy is a powerful tool to image structural information in biomolecular assemblies. Nonlinear interaction between light and matter lead to complex processes where coherent combinations of optical fields couple to assemblies of molecular transition dipoles. Controlling polarized optical fields and monitoring nonlinear induced signals in a medium can nevertheless bring rich information on molecular orientational organization within the focal spot of a microscope ob jective. In this PhD thesis we apply this polarization sensitivity to different label-free optical coherent techniques (coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), stimulated Raman scattering (SRS)) and to two-photon fluorescence (2PEF) to retrieve quantitative information on the staticmolecular distribution shape and orientation of lipids in model membranes and biological membranes such as myelin sheaths in spinal cord tissues. With this technique, we address fundamental questions about lipid packing behavior in membranes, and how it can be affected by other molecules such as cholesterol and the insertion of fluorescent lipidprobes. We demonstrate that polarization resolved CARS give access to fine details on lipids arrangement in myelin sheaths, at a sub-diffraction scale. In the context of experimental autoimmune encephalomyelitis disease (EAE) we show, that even at the stage of disruption of the myelin envelope during the demyelination process, lipids multilayersreveal strong capability to preserve their macroscopic self-assembly into highly organized structures, with a degree of disorganization occurring only at the molecular scale. At last, we show that such technique can be combined with a larger scope of studies in bioimaging; we use multimodal microscopy (combined CARS and 2PEF) to image axonaldegeneration and immune cell recruitment associated to demyelination process in order to address biological questions related to the immune response and axon damage during progression of the neurodegenerative disease.La microscopie non-linéaire résolue en polarisation est un outil puissant pour accéder à des informations structurelles dans les assemblages biomoléculaires. Les interactions non-linéaire entre matière et lumière induisent des processus complexes où des champs électromagnétiques cohérents interagissent avec les dipôles de transitions moléculaires. Le contrôle de la polarisation des champs électromagnétiques excitateurs et l’étude desréponses non-linéaires induites procurent de riches informations sur la distribution angulaire des molécules présentes dans le volume focal de l’objectif du microscope. Dans cette thèse, nous appliquons cette sensibilité à la polarisation à plusieurs modalités de microscopie cohérentes sans marquage (diffusion cohérente Raman anti-Stokes (CARS), diffusion Cohérente stimulée (SRS)) et à la fluorescence à deux photons (2PEF) afind’obtenir des informations quantitatives sur la forme de la distribution moléculaire et l’orientation des lipides dans les membranes artificielles, ainsi que dans les membranes biologiques telles que la myéline des tissues de la moelle épinière. Avec cette technique, nous adressons une question fondamentale sur le comportement des ensembles lipidiques dans les membranes et sur l’effet d’autres molécules telles que le cholestérol et les marqueursfluorescents. Nous démontrons que le CARS résolu en polarisation permet d’accéder à de fines informations sur l’organisation des lipides dans les membranes de la myéline, en deçà de la limite de diffraction. Dans le contexte de l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), nous démontrons que même au stade de la perturbation de la couche de myéline lors du processus de démyélinisation, les multicouches de lipides présentent une fortecapacité de préserver leur auto-assemblage macroscopique en présentant une structure hautement organisée avec un niveau de désorganisation qui ne se retrouve qu’à l’échelle moléculaire. Finalement, nous démontrons qu’une telle technique peut être combinée à d’autres pour un plus grand éventail d’études en bio-imagerie; nous utilisons la microscopie multimodale (combinaison de CARS et de 2PEF) pour imager la dégénération des axones et le recrutement de cellules immunitaires associé au processus de démyélinisation afin d’adresser des questions biologiques reliées à la réponse immunitaire et les dommages des axones durant la progression des maladies neurodégénératives