Caratterizzazione del ruolo extracromosomale dell'istone H2B durante la citochinesi

Histones are constitutive components of nucleosomes, the basic units of DNA packaging in eukaryotes and their post-translational modifications regulate chromatin structure. Among different modifications, specific phosphorylation of the N-terminal tail of H2B, at S14 in vertebrate and S10 in yeast, has been linked to DNA damage response (DDR) and chromatin condensation in apoptosis and meiosis. In addition to chromatin-related functions, a few extrachromosomal activities of specific histones have been described. Recently, our laboratory demonstrated that histone H2B localizes at the midbody, the intercellular bridge connecting two daughter cells during cytokinesis. The cytokinetic specific localization of histone H2B is independent of the presence of chromosome bridges at the cleavage plan, indicating a distinct role from chromatin organization of histone H2B. At the midbody, H2B is phosphorylated at S14 (H2B-S14P) by Homeodomain interacting protein kinase 2 (HIPK2), a kinase involved in DDR and development, whose activity is required for cytokinesis and prevention of tetraploidization. In HIPK2-defective cells, expression of a phosphomimetic H2B-S14D mutant is sufficient to overcome cytokinesis defects and rescue cell division and proliferation. This unexpected finding uncovers new role of extrachromosomal histone H2B in cell division. However, the function exerted by histone H2B in cytokinesis is unknown. Here we show that histone H2B-S14P localizes in specific areas, during different steps of cell division, from metaphase to telophase. Furthermore, in late telophase, at the abscission onset, H2B-S14P show an asymmetric distribution probably due to a specific sub-structural localization. Moreover, we show that the midbody localization of histone H2B is independent of both DNA and RNA. In addition, microscopic studies and live-cell imaging of HeLa cells depleted for histone H2B revealed that histone H2B is necessary for faithful cytokinesis. Indeed, depletion of H2B results in prevention of cell cleavage, accumulation of the connections between daughter cells with the formation of long intercellular bridges (LIBs), and abscission defects and delay. H2B depletion results in tubulin disorganization, presumably linked to LIBs formation and the stretching conditions triggered by abscission defects, thus supporting a role for histone H2B in cytokinesis. Furthermore, in HeLa cells, H2B depletion do not affect the spatio-temporal localization of proteins at the cleavage furrow (e.g., Aurora B, INCENP, PRC1 and PLK1). In the subsequent stage, the midbody formation, PLK1, PRC1, Aurora B, Survivin, INCENP, ECT2, MKLP1 and HIPK2, are present at the midbody and follow the tubulin structures. In contrast, severe defects of localization and organization are observed for the abscission factors ALIX, ESCRT-III subunit CHMP4B, and Spastin, while the localization of Citron kinase is not affected. By in vitro biochemical assays, we show that H2B directly interacts with CHMP4B (Charged Multivesicular Body Protein 4B), a core subunit of the ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport-III)-dependent filaments, recently identified as cortical constriction helices required for abscission. Overall, our data indicate that histone H2B is an important regulator of the final step of cell division and reveal a novel function of extrachromosomal histone H2B for a faithfulness abscission.Gli istoni sono i componenti strutturali dei nucleosomi, le unità fondamentali della cromatina responsabili della compattazione del DNA eucariotico, le cui modifiche post-traslazionali regolano la struttura della cromatina stessa. Tra le varie modifiche, la fosforilazione della coda N-terminale dell’istone H2B, in serina 14 (S14) nei vertebrati e in serina 10 (S10) in lievito, è stata correlata alla risposta al danno al DNA (DDR) e alla condensazione della cromatina durante l’apoptosi e la meiosi. Oltre alle funzioni relate alla cromatina, per diversi istoni sono state identificate specifiche funzioni extracromosomali. Recenti studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l’istone H2B si localizza al midbody, il ponte inter-cellullare che connette le due cellule figlie durante la citochinesi. La localizzazione dell’istone H2B al midbody avviene in maniera indipendente dalla presenza di DNA indicando che, in citochinesi, l’istone H2B svolge un ruolo diverso rispetto a quello svolto nella organizzazione della cromatina. Al midbody l’istone H2B viene fosforilato in S14 (H2B-S14P) dalla serina/treonina chinasi homeodomain interacting protein kinase 2 (HIPK2), una chinasi coinvolta nel DDR, nello sviluppo e che svolge un ruolo anche nella citocinesi, prevenendo la tetraploidizzazione. In cellule mancanti per HIPK2, l’espressione dell’istone H2B fosfomimetico H2B-S14D determina la scomparsa dei difetti di citochinesi e garantisce una corretta divisione cellulare. Questi studi hanno pertanto rivelato un nuovo ruolo extracromosomale dell’istone H2B durante la divisione cellulare ma la funzione svolta dall’istone H2B nella citochinesi resta ignota. I dati di questa tesi dimostrano che l’istone H2B-S14P si localizza in specifiche aree, durante le varie fasi del ciclo cellulare, dalla metafase alla telofase. In particolare, è stato visto che in tarda telofase, quando inizia l’abscission, H2B-S14P si distribuisce in maniera asimmetrica lungo le regioni fiancheggianti il midbody, probabilmente a causa di una diversa localizzazione sub-strutturale. Inoltre, è stato dimostrato che l’istone H2B si localizza al midbody in maniera indipendente sia dal DNA che dal RNA. Studi condotti su cellule HeLa in cui è stata ridotta l’espressione dell’istone H2B, evidenziano che tale istone è necessario per garantire una corretta divisione cellulare. Infatti, la mancanza dell’istone H2B causa difetti nella divisione cellulare con accumulo di lunghi ponti intercellulare (long intercellular bridges, LIBs), tra le due cellule in divisione, oltre a difetti e rallentamento dell’abscission. La deplezione dell’istone H2B causa anche la disorganizzazione della tubulina probabilmente legata sia alla formazione di LIBs che ai difetti dell’abscission. Inoltre, è stato visto che la riduzione dei livelli dell’istone H2B in cellule HeLa non crea difetti nella localizzazione spazio-temporale di proteine che si localizzano nel sito di divisione cellulare e che sono coinvolte nelle regolazione delle prime fasi della citochinesi (e.g. Aurora B, Survivin, PRC1 and PLK1). Proteine coinvolte nella successiva fase di formazione del midbody quali PLK1, PRC1, Aurora B, Survivin, INCENP, ECT2, MKPL1 e HIPK2, riescono a localizzarsi al ponte intercellulare ma la loro distribuzione segue la struttura aberrante della tubulina. Al contrario, sono stati riscontrati rilevanti difetti di localizzazione delle proteine dell’abscission quali ALIX, CHM4B e Spastin, coinvolte nella ultima fase della divisione cellulare mentre la localizzazione di proteine quali Citron kinase non risulta essere aberrante in assenza di H2B. Ulteriori studi dimostrano che l’istone H2B interagisce direttamente con CHMP4B (Charged Multivesicular Body Protein 4B), una delle sub-unità del complesso ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport-III) recentemente identificato come costituente della struttura ad elica che induce la restrizione del ponte intercellulare richiesta durante l’abscission. Una analisi complessiva di questa dati indica pertanto che l’istone H2B è un importante regolatore della fase finale della citochinesi e identifica una nuova funzione extracromosomale dell’istone H2B durante l’abscssion.Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellular