Role of the nucleotide oligomerization domain-like receptor protein 7 in the pathology of recurrent hydatidiform moles

A molar pregnancy or hydatidiform mole (HM) is a human pregnancy with no embryo, but cystic degeneration of chorionic villi and excessive proliferation of the trophoblast. Mutations in NLRP7, a member of the nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing receptors family of proteins with roles in inflammation and apoptosis, are responsible for recurrent hydatidiform moles (RHMs). In previous studies, we demonstrated that ex vivo stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with NLRP7 mutations secrete lower levels of interleukin 1 beta (IL1B) and tumor necrosis factor (TNF) than control cells despite the fact that patients' cells have normal to slightly higher intracellular levels of IL1B. We hypothesized that NLRP7 mutations do not alter IL1B synthesis or processing but affect the microtubules and consequently intracellular cytokines trafficking. To address this hypothesis, I first characterized the expression and subcellular localization of NLRP7 in PBMCs. Using immunofluorescence, I showed that NLRP7 is expressed in all PBMC subpopulations before and after LPS stimulation including monocytes, which are the main cells that express and secrete IL1B and TNF in response to LPS stimulation. Additionally, I found that NLRP7 localizes to the microtubule organizing center (MTOC) and the Golgi apparatus in various hematopoietic cell lines. The localization of NLRP7 to the MTOC and Golgi drew our attention to check for any possible dependence of NLRP7 signal on microtubules at these two locations. Toward this goal, I treated Epstein Barr Virus transformed B-lymphocytes (EBV) cells from control subjects with nocodazole, a microtubule disrupting agent, and found that this treatment disrupts the NLRP7 signal, which became more diffuse and fragmented around the nucleus. These results suggest that NLRP7 mutations impair cytokine secretion by affecting microtubules. The identification of KHDC3L as the second gene for RHMs prompted us to investigate the expression and subcellular localization of its protein in hematopoietic cells. Using immunofluorescence, I found that KHDC3L co-localizes with NLRP7 to the MTOC and Golgi apparatus in control EBV cells (data not shown). The similarities in the subcellular localization of NLRP7 and KHDC3L suggested that they may share a common function in IL1B and TNF secretion. To understand the role of NLRP7 and KHDC3L in RHMs, I sought to determine their subcellular localization in control human oocytes and early cleavage embryos, stages at which the disease starts. Using confocal immunofluorescence and electron microscopies, I found that NLRP7 co-localized with KHDC3L mainly to the cortical region in oocytes from the germinal vesicle (GV) until the formation of the zygote. Within the cortex, electron and high resolution confocal microscopies confirmed the co-localization of NLRP7 and KHDC3L between cortical granules, mitochondria, and other organelles on oocyte cytoskeletal structures subsequently identified as the human subcortical maternal complex (SCMC). Additionally, we found that NLRP7 co-localizes with OOEP, another member of the SCMC and depends on alpha tubulin microtubules and filamentous actin networks. Between 2-cell and morula stages, both NLRP7 and KHDC3L signals were restricted to the outer cortical regions and absent from the cell-to-cell contact region. At the blastocyst stage, NLRP7 and KHDC3L relocate to the cytoplasm and nucleus, respectively, of the inner cell mass (ICM) and the trophectoderm. Collectively, our data implicate roles for NLRP7 and KHDC3L directly or indirectly in the cytoskeleton and open up new areas of research to investigate the role of these two maternal-effect proteins in the manifestation of HM.La grossesse molaire ou môle hydatiforme (HM) est une pathologie de la grossesse humaine caractérisée par l'absence du développement embryonnaire, la dégénérescence kystique des villosités choriales et la prolifération excessive du trophoblaste. Des mutations du gène NLRP7, membre de la famille NLRP jouant un rôle dans l'inflammation et l'apoptose, sont responsables de môles récurrentes (RHMs). Nous avons auparavant démontré que les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), isolées de patientes ayant des mutations de NLRP7, sécrètent des interleukines 1 bêta (IL1B) et des facteurs de nécrose tumorale (TNF) à un taux inférieur à celui des cellules contrôles alors même que le taux intracellulaire d'IL1B est normal ou légèrement augmenté dans les cellules de patientes. Suite à ces observations, nous avons émis l'hypothèse que les mutations de NLRP7 ne modifient pas la synthèse ou le processus de maturité d'IL1B mais affectent les microtubules et par conséquence le trafic intracellulaire des cytokines. Pour vérifier cette hypothèse, j'ai d'abord caractérisé l'expression et la localisation cellulaire de NLRP7 dans les PBMCs par immunomarquage. NLRP7 est exprimée dans toutes les sous-populations de PBMCs avant et après la stimulation par LPS, y compris les monocytes, les principales cellules sécrétant IL1B et TNF après stimulation. En outre, j'ai trouvé que NLRP7 se localise au niveau du centrosome et de l'appareil de Golgi dans plusieurs lignées hématopoïétiques. Cette localisation nous a incités à vérifier une éventuelle dépendance du signal de NLRP7 sur les microtubules à ces deux endroits. Dans ce but, j'ai traité des cellules EBV contrôles avec du nocodazole, un agent de dépolymérisation microtubulaire, et constaté que ce traitement perturbe le signal de NLRP7, qui devient plus diffus et fragmenté autour du noyau. Ces résultats suggèrent que les mutations du NLRP7 altèrent la sécrétion de cytokines en affectant les microtubules. J'ai également caractérisé l'expression et la localisation de KHDC3L, la protéine du second gène responsable de RHM, dans les cellules hématopoïétiques. J'ai montré la co-localisation de KHDC3L et de NLRP7 au centrosome et l'appareil de Golgi dans des cellules EBV contrôles (résultats non montrés). La similitude dans la localisation cellulaire de NLRP7 et KHDC3L suggère que ces deux protéines peuvent partager une fonction commune dans la sécrétion d'IL1B et de TNF. Pour comprendre le rôle de NLRP7 et KHDC3L dans les RHMs, j'ai caractérisé leurs localisations cellulaires dans des ovocytes et des embryons humains contrôles, les stades de développement au cours desquels la maladie commence. En utilisant l'immunomarquage et le microscope confocal, j'ai trouvé que NLRP7 co-localise avec KHDC3L principalement à la région corticale dans les ovocytes au stade de vésicule germinale (GV) jusqu'à celui de la formation du zygote. En utilisant la microscopie électronique et le confocal à haute résolution, j'ai confirmé la localisation de NLRP7 et de KHDC3L au niveau du cortex entre les granules corticaux, les mitochondries et différents organites. J'ai également constaté que NLRP7 s'attache sur des structures ovocytaires identifiées par la suite comme le complexe maternel sous-cortical (SCMC), co-localise avec OOEP, un autre membre de la SCMC et dépend des microtubules et des filaments d'actine. Au stade embryonnaire de deux cellules et morula, NLRP7 et de KHDC3L étaient présentes à la région corticale externe et exclues des zones de contact entre blastomères. Au stade du blastocyste, NLRP7 et KHDC3L se déplacent dans le cytoplasme et le noyau, respectivement, du bouton embryonnaire et du trophectoderme. Au total, nos données impliquent NLRP7 et KHDC3L directement ou indirectement dans le cytosquelette et ouvrent de nouveaux horizons de recherche pour étudier le rôle de ces deux protéines à effet maternel dans la physiopathologie des grossesses molaires