Epidemiological study on Caseous Lymphadenitis in small ruminants in the Alto Alentejo region (Portugal) and evaluation of molecular and serological techniques in the diagnosis of the disease

La Linfadenitis caseosa (LC) o pseudotuberculosis es una enfermedad piógena, causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que afecta principalmente a pequeños rumiantes, si bien también se ha descrito en ciervos, vacas, caballos, cerdos y humanos. A pesar de su distribución mundial y su impacto económico en la producción ovina y caprina, su prevalencia real y distribución están subestimadas en aquellos países donde no se considera una enfermedad de declaración obligatoria. El presente trabajo es el primer estudio de seroprevalencia de LC realizado en el Alto Alentejo, principal región ganadera de Portugal, con el objetivo de (1) evaluar la validez y utilidad de diversas técnicas de diagnóstico serológico y molecular, (2) realizar una encuesta transversal de la seroprevalencia de C. pseudotuberculosis en los pequeños rumiantes, (3) realizar un estudio preliminar de los factores de riesgo asociados a la seropositividad y (4) describir los casos clínicos encontrados. Para ello, se tomaron muestras de suero a 756 animales procedentes de 82 explotaciones, así como muestras de abscesos y pus a 58 animales con lesiones piogranulomatosas cutáneas y viscerales. A fin de mejorar la sensibilidad de la PCR múltiple para la identificación de C. pseudotuberculosis a partir de muestras purulentas, previamente al estudio se determinó la validez de esta prueba tras incluir una dilución (1:10) de las muestras de ADN. Los resultados obtenidos no mostraron ninguna mejora en su validez diagnóstica, por lo que consideramos que la dilución sólo debería aplicarse en lesiones muy purulentas que resulten negativas al protocolo clásico. Por su parte, la comparación del test ELISA directo (ELITEST CLA # CK105A®) con la PCR múltiple (prueba de referencia) mostró una sensibilidad y especificidad diagnósticas del 100% y el 76,1%, respectivamente, con una Razón de Probabilidad de 4,78 para los resultados positivos y superior a 100 para los negativos. En base ello, el ELISA ofrecería una certeza del 100% al descartar la LC, independientemente de la probabilidad preprueba, pero la credibilidad de los resultados positivos sólo sería ≥ 80% cuando la prevalencia real en el colectivo fuese ≥ 46%. El estudio epidemiológico de la infección por C. pseudotuberculosis reflejó una seroprevalencia a nivel de granja (dispersión) del 75,4% (IC95% [66,4%-84,5%]), con un 16,7% de la cabaña ovina y caprina afectada (IC95% [14,1%-19,4%]), encontrando una susceptibilidad significativamente mayor en la especie caprina (RP 4,0 IC95% [3,31- 4,84]), en los animales de aptitud lechera (RP 2,91 IC95% [2,49-3,42]) y en aquellos criados en régimen de producción no extensivo (RP 4,19 IC95% [3,67-4,79]) y/o en granjas de mediano y gran tamaño. Finalmente, el estudio patológico confirmó la importancia de la forma visceral, especialmente en la especie ovina. Los resultados hallados en esta Tesis confirman la importancia sanitaria de la Linfadenitis caseosa en los pequeños rumiantes en Portugal, así como la utilidad de la técnica ELISA directa en la detección de casos subclínicos y como prueba de cribado en programas de lucha.Caseous lymphadenitis (CL) or pseudotuberculosis is a pyogenic disease, caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, affecting mainly small ruminants, although it has also been described in deer, cows, horses, pigs, and humans. Despite its worldwide distribution and its economic impact on sheep and goat production, its real prevalence and distribution are underestimated in countries where CL it is not considered a notifiable disease. The present work is the first seroprevalence study in CL carried out in Alto Alentejo, the main livestock region of Portugal, with the aim of (1) assessing the validity and usefulness of various serological and molecular diagnostic techniques, (2) conducting a cross-sectional survey of the seroprevalence of C. pseudotuberculosis in small ruminants, (3) conducting a preliminary study of the risk factors associated with seropositivity and (4) describing the clinical cases found. To meet this aim, serum samples were taken from 756 animals in 82 farms, as well as abscess and pus samples from 58 animals with skin and visceral pyogranulomatous lesions. Prior to the study and to improve the sensitivity of multiplex PCR for the identification of C. pseudotuberculosis from purulent samples, the validity of this test was determined after including a dilution (1:10) of the DNA samples. The results obtained showed no improvement in their diagnostic validity, so we consider that the dilution should only be applied in highly purulent lesions that are negative to the classical protocol. The comparison of the direct ELISA test (ELITEST CLA # CK105A®) with the multiplex PCR (reference test) showed a diagnostic sensitivity and specificity of 100% and 76.1%, respectively, with a Probability Ratio of 4.78 for positive results and greater than 100 for negative ones. On this basis, the ELISA would offer 100% certainty in discarding CL, regardless of the pretest probability, but the credibility of positive results would only be ≥ 80% when the real prevalence in the group was ≥ 46%. The epidemiological study of C. pseudotuberculosis infection reflected a seroprevalence at the farm level (dispersion) of 75.4% (95% CI [66.4% -84.5%]), with 16.7% of affected small ruminants (95% CI [14.1% -19.4%]), finding significantly greater susceptibility in the caprine species (PR 4.0 95% CI [3.31-4.84]), in dairy animals (PR 2.91 95% CI [2.49 -3.42]) and in those raised in a non-extensive production regime (PR 4.19 95% CI [3.67- 4.79]) and / or in medium and large farms. Finally, the pathological study confirmed the importance of the visceral form of the disease, especially in sheep species. The results found in this thesis confirm an actual problem and point out the importance of CL in small ruminants in Portugal, as also the usefulness of the direct ELISA technique in the detection of subclinical cases and as a screening test in disease control programs