Nuevas perspectivas para la horticultura urbana: evaluación de un biofilm bacteriano como promotor del crecimiento vegetal

Programa Oficial de Doutoramento en Investigación Agraria e Forestal. 5022V01[Resumen]La aplicación de bacterias promotoras del crecimiento vegetal, cuyos efectos involucran el mejoramiento de las propiedades fisicoquímicas y la salud del suelo, como así también el crecimiento y la productividad de los cultivos, han tomado gran relevancia debido a ser una práctica más amigable con el ambiente. Hoy en día se presentan como una potente alternativa al uso de pesticidas y fertilizantes de origen químico con el reconocido impacto negativo que estos productos producen en el ambiente. El objetivo de esta tesis doctoral fue producir y analizar la eficacia de un biofilm de origen bacteriano como agente promotor del crecimiento en Lactuca sativa y Solanum lycopersicum crecidos en sustratos que asemejan suelos de huertas urbanas y en sustratos contaminados con metales. Fueron evaluadas cepas bacterianas del género Bacillus: B. amylolyticus, B. subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis var. natto, B. liquefaciens 235 y B. liquefaciens 157 como “agentes de control biológico” contra los hongos fitopatógenos: Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium ultimum y Rhizoctonia solani. La bacteria seleccionada fue Bacillus subtilis subsp. spizizenii, la cual en condiciones de laboratorio liberó metabolitos de origen proteico y otros con propiedades biosurfactantes y emulsificantes capaces de desestabilizar las membranas de los microorganismos patógenos. Esta cepa actuó como “biofertilizante”, debido a su capacidad para solubilizar y mineralizar fósforo, pero no presentó actividad fijadora de nitrógeno. Asimismo, resultó ser “fitoestimuladora”, por producir hormonas del tipo ácido indol acético, ácido abscísico y zeatín ribósido. Por ello, B. subtilis subsp. spizizenii se posicionó como una alternativa promisoria para ser utilizada como inoculante de semillas para la promoción del crecimiento vegetal. Posteriormente, se optimizaron en el laboratorio, las condiciones de cultivo para que la bacteria desarrolle un biofilm robusto, con el propósito de utilizar esta estructura como un novedoso método de inoculación de semillas. Para tal fin fueron evaluadas fuentes nitrogenadas complejas a base de peptona y extracto de levadura y fuentes nitrogenadas simples con distintos aminoácidos, resultando el más adecuado el ácido L-glutámico. Se probaron distintas fuentes carbonadas de cinco y seis carbonos, siendo la más adecuada el glicerol. Otras condiciones que resultaron apropiadas para el desarrollo del biofilm fueron: temperatura de 30°C y cultivo en condiciones estáticas durante 96 horas. Bajo estas condiciones en el biofilm también se desarrollaron esporas, que resultó de suma importancia debido a que la viabilidad de la bacteria no solo estaba asegurada con la estructura de protección que ofrece el biofilm, sino también con las estructuras de resistencia que son las esporas. Se comprobó el efecto promotor del crecimiento de B. subtilis subsp. spizizenii sobre tres variedades de Lactuca sativa: L. sativa var Crimor; L. sativa var. Waldman Green y L. sativa var. Grand Rapid y sobre dos variedades de Solanum lycopersicum: S. lycopersicum var. Platense y S. lycopersicum var. Río Grande. En L. sativa var. Gran Rapid y S. lycopersicum var. Río Grande se compararon dos métodos de inoculación: el método convencional con un inóculo líquido (forma planctónica) y bajo la forma del biofilm. Se evaluaron parámetros de crecimiento (biomasa aérea y radicular) y además, en el caso de S. lycopersicum parámetros de rendimiento y calidad de frutos. Para ambas especies vegetales la aplicación del biofilm resultó ser la más efectiva. En sustratos contaminados con cobre o zinc la aplicación del biofilm también mostró en estas especies hortícolas un efecto beneficioso tanto en los parámetros de crecimiento como en algunos parámetros de rendimiento y calidad de frutos. En el presente trabajo se pone de manifiesto la importancia de la incorporación de biofilms como método innovador para la inoculación de bacterias con actividad promotora del crecimiento en especies vegetales tanto en sustratos que asemejan suelos de huertas urbanas como en sustratos contaminados con metales.[Abstract] The application of plant growth promoter bacteria has significant benefits such as the improvement of the physicochemical properties and the health of the soil, as well as the growth and productivity of crops. This practice has become extremely relevant as it is much more environmentally friendly and an invaluable alternative to the use of pesticides and fertilizers of chemical origin known for their negative impact on the environment. The aim of this doctoral thesis was to produce and analyze the efficacy of a biofilm of bacterial origin as a promoter of plant growth in Lactuca sativa and Solanum lycopersicum grown on substrates that resemble soils of urban gardens and on substrates contaminated with metal. Bacterial strains of the Bacillus genus were evaluated: B. amylolyticus, B. subtilis subsp. spizizeni, Bacillus subtilis var. natto, B. liquefaciens 235 and B. liquefaciens 157 as “biological control agents” against phytopathogenic fungi: Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium ultimum and Rhizoctonia solani. The selected bacteria was Bacillus subtilis subsp. spizizenii, which under laboratory conditions released protein metabolites and other metabolites with biosurfactant and emulsifying properties capable of desestabilizing the membranes of pathogenic microorganisms. This strain acted as a “biofertilizer”, due to its ability to solubilize and mineralize phosphorus, but it did not show nitrogen-fixing activity. Likewise, it turned out to be a “phytostimulant”, as it produced hormones such as indole acetic acid, abscisic acid and zeatin riboside. Therefore, B. subtilis subsp. spizizenii was positioned as a promising alternative to be used as a seeds inoculant for the promotion of plant growth. Subsequently, the culture conditions were optimized in the laboratory for the bacteria to develop a robust biofilm, to be used as a novel seed inoculation method. For this purpose, complex nitrogenous sources based on peptone and yeast extract and simple nitrogen sources with different amino acids were evaluated, the most suitable being Lglutamic acid. Different carbonate sources of five and six carbons were tested, the most suitable being glycerol. Other conditions that were appropriate for the development of the biofilm were: temperature of 30 ° C and cultivation under static conditions for 96 hours. Under these conditions, spores also developed in the biofilm. This was of utmost importance because in this way the viability of the bacteria is not only ensured under the structure of the biofilm, which constitutes a protected environment, but also with the presence of spores, which are resistance structures. The growth promoting effect of B. subtilis subsp. spizizenii was confirmed on three varieties of Lactuca sativa: L. sativa var Crimor, L. sativa var. Waldman Green and L. sativa var. Grand Rapid and on two varieties of Solanum lycopersicum: S. lycopersicum var. Platense and S. lycopersicum var. Río Grande. Two methods of inoculation of the bacteria were compared in L. sativa var. Gran Rapid and S. lycopersicum var. Río Grande: on the one hand, the conventional method with a liquid inoculum (planktonic form) and on the other, the biofilm. Growth parameters (aerial and root biomass) were evaluated as well as yield and fruit quality parameters in the case of S. lycopersicum. For both plant species the application of the biofilm turned out to be the most effective. In substrates contaminated with copper and zinc, the application of the biofilm also showed a beneficial effect in these horticultural species both in the growth parameters and in some parameters of yield and fruit quality. The present work highlights the importance of the incorporation of biofilms as an innovate method for the inoculation of bacteria with growth-promoting activity in plant species.[Resumo] A aplicación de bacterias que promoven o crecemento das plantas, cuxos efectos implican a mellora das propiedades fisicoquímicas e a saúde do solo, así como o crecemento e a produtividade dos cultivos, tiveron gran relevancia debido a ser unha práctica máis amigable co ambiente. Hoxe preséntanse como unha poderosa alternativa ao uso de pesticidas e fertilizantes de orixe química co recoñecido impacto negativo que estes produtos producen no medio ambiente. O obxectivo desta tese de doutoramento é producir e analizar a eficacia dun biofilme de orixe bacteriano como axente promotor do crecemento en Lactuca sativa e Solanum lycopersicum cultivados en substratos que se asemellan aos solos de hortas urbanas e en substratos contaminados con metais. Avaliáronse as cepas bacterianas do xénero Bacillus: B. amylolyticus, B. subtilis subsp. spizizeni, Bacillus subtilis var. natto, B. liquefaciens 235 e B. liquefaciens 157 como "axentes de control biolóxico" contra os fungos fitopatóxenos Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium ultimum e Rhizoctonia solani. A bacteria seleccionada foi Bacillus subtilis subsp. spizizenii, que en condicións de laboratorio liberou metabolitos de orixe proteica e outros con propiedades biosurfactantes e emulsionantes capaces de desestabilizar as membranas dos microorganismos patóxenos. Esta cepa actuou como un "biofertilizante", debido á súa capacidade para solubilizar e mineralizar o fósforo, pero non mostrou actividade fixadora de nitróxeno. Do mesmo xeito, resultou ser un "fitoestimulador", xa que produce hormonas como o ácido indol acético, o ácido abscísico e zeatín ribósido. Polo tanto, B. subtilis subsp. spizizenii posicionouse como unha prometedora alternativa para usar como inoculante de sementes para o fomento do crecemento das plantas. Posteriormente, optimizáronse as condicións de cultivo no laboratorio para que a bacteria desenvolva un biofilme robusto, co propósito de usar esta estrutura como un novo método de inoculación de sementes. Para este efecto avaliáronse fontes nitroxenadas complexas baseadas en peptona e extracto de fermento e fontes nitroxenadas simples con diferentes aminoácidos, sendo o máis adecuado o ácido L-glutámico. Probáronse distintas fontes de carbonato de cinco e seis carbonos, sendo a máis adecuada o glicerol. Outras condicións adecuadas para o desenvolvemento do biofilme foron: temperatura de 30 °C e cultivo en condicións estáticas durante 96 horas. Nestas condicións no biofilme as esporas tamén se desenvolveron, o que foi de suma importancia porque non só se garante a viabilidade das bacterias baixo a estrutura do biofilme, que constitúe un ambiente protexido, senón tamén coa presenza de esporas, que son estruturas de resistencia. Comprobouse o efecto promotor do crecemento de B. subtilis subsp. spizizenii en tres variedades de Lactuca sativa: L. sativa var. Crimor; L. sativa var. Waldman Green e L. sativa var. Grand Rapid e en dúas variedades de Solanum lycopersicum: S. lycopersicum var. Platense e S. lycopersicum var. Río Grande. En L. sativa var. Great Rapid e S. lycopersicum var. Río Grande comparáronse dous métodos de inoculación: o método convencional cun inóculo líquido (forma planctónica) e en forma de biofilme. Avaliáronse os parámetros de crecemento (biomasa aérea e da raíz) e tamén, no caso de S. lycopersicum, os parámetros de rendemento e calidade do froito. Para ambas as especies vexetais, a aplicación do biofilme resultou ser a máis eficaz. En substratos contaminados con cobre ou cinc, a aplicación do biofilme tamén mostrou un efecto beneficioso nestas especies hortícolas tanto nos parámetros de crecemento como nalgúns parámetros de rendemento e calidade dos froitos. No presente traballo ponse de relevo a importancia da incorporación de biofilmes como método innovador para a inoculación de bacterias con actividade promotora do crecemento en especies vexetais.