Development of Bioimage Analysis tools for the study of neurogenesis and neurodegeneration

ANTECEDENTES La combinación sinérgica de métodos automatizados de captura y análisis de bioimagen está emergiendo como un enfoque de vanguardia para abordar muchas cuestiones biológicas. Sin embargo, hay muchos campos en los que estas técnicas aún no se implementan y, en cambio, todavía se basan en la inspección visual y el análisis manual, que inevitablemente limitan el rendimiento alcanzable y son más propensos a introducir el sesgo del investigador. Por lo tanto, aún queda un gran esfuerzo por hacer en la difusión del uso de tecnologías de bioimagen de vanguardia en los campos de las ciencias de la vida con una gran dependencia de métodos de microscopía. En la presente tesis, nuestro objetivo ha sido desarrollar y aplicar métodos de bioimagen automatizados al estudio del cerebro adulto, en particular en las áreas de estudio de la biología de las células madre neurales (NSC, del inglés neural stem cells) y el proceso de remielinización de axones. Con respecto a las NSC, la zona subependimaria (SEZ, del inglés, subependymal zone) de los ventrículos laterales es el área neurogénica más extensa y activa en el cerebro mamífero adulto. En el nicho de la SEZ, las NSC coexistentes muestran estados proliferativos heterogéneos que pueden agruparse en dos condiciones principales, quiescencia o activación. Las NSCs activadas producen neuroblastos, que migran para integrarse como neuronas maduras en el bulbo olfatorio. El estudio de la biología de las NSC adultas, a pesar de alcanzar su mayor nivel de complejidad cuando se realiza in vivo, se basa en gran medida en ensayos in vitro que permiten una descomposición y manipulación mucho más fácil y versátil de las variables del sistema. El aislamiento y la expansión de NSCs de la SEZ de ratones adultos es posible en condiciones de cultivo definidas. Se induce un estado proliferativo mediante el crecimiento de células disgregadas en condiciones no adhesivas en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y / o factor de crecimiento epidérmico (EGF) como mitógenos. En estas condiciones, una pequeña población de células comienza a proliferar formando agregados clonales flotantes conocidos como neuroesferas. Las neuroesferas primarias se pueden disociar para subcultivar las células individuales obtenidas, propagando así el cultivo con la formación de neuroesferas secundarias. Además, cultivados sobre un sustrato adhesivo en presencia de suero, se pueden inducir la diferenciación de las NSCs. De este modo, los cultivos de neuroesferas se han convertido en una técnica central para el estudio de las NSC adultas en un entorno altamente controlado. En las últimas décadas se han desarrollado diferentes ensayos para evaluar específicamente sus propiedades básicas, que han permitido un gran avance en nuestro conocimiento sobre la neurogénesis adulta y el mantenimiento y regeneración del tejido neural. No obstante, no se ha aprovechado el potencial de estos modelos in vitro en forma de rastreos a gran escala basados ​​en microscopía. Por el contrario, la mayoría de los análisis actuales se realizan normalmente de forma manual o, como mucho, con la ayuda de software, pero dependiendo de la supervisión del investigador. Por otro lado, los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central (CNS, del inglés central nervous system). Extienden sus procesos alrededor de los axones para formar la capa aislante rica en lípidos conocida como vaina de mielina, cuyas funciones principales son proporcionar apoyo metabólico a los axones subyacentes y potenciar la transmisión rápida de potenciales de acción a lo largo del axón. En el cerebro adulto, los oligodendrocitos mielinizantes maduros son generados por las células precursoras de oligodendrocitos (OPC, del inglés oligodendrocyte precursor cells) que residen en el parénquima cerebral y por las NSCs subependimarias. Para el estudio de la remielinización de axones se han desarrollado una serie de modelos in vivo que consisten en causar una lesión desmielinizante mediante la administración de toxinas para, más tarde, estudiar el proceso de la remielinización. El análisis de estos experimentos se ha basado clásicamente en la captura de imágenes de microscopía electrónica de alta resolución seguidas de anotación manual para la cuantificación. A lo largo de los años se han implementado algunos protocolos de análisis de bioimagen para cuantificar la envoltura de mielina por axón en la forma del parámetro conocido como g-ratio. Sin embargo, aunque algunos de ellos alcanzan cierto grado de automatización, su uso no se ha extendido entre los científicos. Además, todas estas herramientas se centran en el g-ratio, pero ninguna mide la lengua citoplásmica interna, un elemento clave en el proceso de (re)mielinización. Este trabajo se ha realizado utilizando exclusivamente software de código abierto y gratuito. La base fundamental del software de código abierto es que su código está disponible públicamente, lo que encaja perfectamente con estándares de la ciencia como el método científico y la validación de resultados a través de un sistema de revisión por pares. En general, el trabajo se ha desarrollado principalmente en ImageJ/Fiji, uno de los softwares más populares para el análisis de imágenes científicas. Además también se han utilizado otros dos programas de código abierto. Por una parte CellProfiler (en conjunto con CellProfiler Analyst), un software dedicado a la cuantificación de fenotipos celulares en rastreos de alto contenido utilizando imágenes de microscopía. Por otro lado ilastik, un programa que implementa una serie de flujos de trabajo de aprendizaje automático (ML, del inglés, machine learning). HIPÓTESIS Consideramos como hipótesis general que la aplicación de métodos de análisis de bioimagen y, cuando sea posible, la adopción de estrategias de rastreo basadas en microscopía, podrían beneficiar enormemente estos dos campos de estudio al aumentar tanto el rendimiento como la estandarización del análisis. Para abordar la hipótesis, seleccionamos escenarios específicos de diversa complejidad que combinaban una configuración experimental, adquisición de imágenes y desarrollo e implementación de estrategias de análisis de bioimagen. OBJETIVOS Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, los objetivos específicos que nos propusimos alcanzar fueron: Implementar un ensayo de rastreo de alto rendimiento para la evaluación in vitro de las propiedades adhesivas y la regulación en cultivos 2D de NSCs. Desarrollar un ensayo de rastreo de alto contenido para el análisis unicelular de la proliferación y apoptosis de NSCs en cultivos 2D. Establecer un ensayo de rastreo de alto rendimiento para la evaluación de la autorrenovación y la capacidad clonal de NSCs a través del análisis poblacional de neuroesferas 3D. Crear un flujo de trabajo semiautomático para mejorar el rendimiento del análisis de bioimagen de modelos de remielinización in vivo utilizando un parámetro novedoso en microscopía electrónica. CAPÍTULO 1 Antecedentes biológicos Las cadherinas son proteínas transmembrana de tipo 1 que establecen uniones adherentes homofílicas, célula-a-célula y dependientes del calcio a través de su dominio extracelular. Los miembros de esta familia de moléculas de adhesión celular desempeñan papeles críticos y variados durante el desarrollo y en la homeostasis adulta. Entre otras funciones, estas moléculas se han relacionado con la regulación del ciclo de activación de quiescencia en varios nichos de células madre. Nuestro laboratorio ha demostrado que la adhesión de las NSC subependimarias a la capa ependimaria a través de N-cadherina (cadherina 2, Cdh2) contribuye a mantener la organización estructural del nicho neurogénico y regula la quiescencia de las NSC. Además, describimos que este papel es dinámico ya que la escisión regulada por N-cadherina por MT5-MMP, una metaloproteinasa de tipo membrana (MMP, del inglés membrane-type metalloproteinase), codificada por el gen Mmp24, promueve la activación de las NSCs en condiciones fisiológicas y regenerativas. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la quiescencia mediada por adhesión no se han dilucidado por completo. Por lo tanto, decidimos explorar la posible implicación en la regulación de la adhesión de las NSCs de otro miembro de la familia MMP, la adamlisina ADAM10. Esta shedasa, como otros miembros de ADAM, contiene dominios de desintegrina y metaloproteasa y se ha observado que escinde la N-cadherina en las neuronas. De hecho, es una de las proteasas más expresadas en el cerebro adulto, incluida la SEZ. Con el fin de investigar los efectos y la regulación de la adhesión mediada por N-cadherina de las NSCs y caracterizar los factores de nicho secretados involucrados en su escisión, hemos desarrollado un ensayo funcional in vitro que modela el anclaje de células subependimarias mediadas por N-cadherina y automatizado su análisis mediante la adopción de una estrategia de captura de imágenes por rastreo y el desarrollo de una herramienta de análisis de bioimágenes para la extracción de los datos cuantitativos relevantes. Configuración experimental y captura de imagen Los ensayos de adhesión celular tienen como objetivo cuantificar el anclaje de células aisladas a superficies recubiertas con ligandos, componentes de la matriz extracelular purificados u otras células, generalmente en forma de monocapas. Para nuestro ensayo de rastreo basado en microscopía, con el fin de imitar en la medida de lo posible las condiciones in vivo, en lugar de utilizar una proteína recombinante purificada como recubrimiento, el sustrato adherente es proporcionado por una monocapa de células vivas que sobreexpresan el ligando de interés. En primer lugar, las neuroesferas se someten a disgregación mecánica con el fin de preservar la integridad de los dominios extracelulares de N-cadherina, y se depositan en una monocapa confluente de fibroblastos NC-L929 que sobreexpresan N-cadherina. En caso de que las NSC interrogadas no sean intrínsecamente fluorescentes, se marcan con el trazador de células DDAO-SE para facilitar su detección. Además, para incluir un control de especificidad, parte de las células se incuban con el anticuerpo bloqueador de N-cadherina GC4 (NcadBlock) para reducir su adhesión mediada por N-cadherina. Una vez que se deja adherir durante un tiempo controlado, las células no adheridas se lavan a fondo y los cultivos se fijan para un análisis adicional. Finalmente, los núcleos se marcan con DAPI para visualizar las células de la monocapa subyacente y las células se fijan para fotografiarlas mediante un microscopio de rastreo automático. Para obtener datos cuantitativos del ensayo se deben realizar dos tareas diferentes: estimar el porcentaje de superficie de cultivo ocupada por la monocapa que expresa N-cadherina y detectar y contar el número de NSCs adheridas a ella. Dado que no se requiere una morfología celular precisa para lograr las tareas mencionadas, decidimos capturar imágenes de baja resolución. De hecho, las condiciones de obtención de imágenes se han configurado para llegar a un compromiso entre reducir el tamaño de la imagen al mínimo y aún poder detectar de manera eficiente los objetos de interés, lo cual supone un ahorro enorme de espacio al tratarse de un ensayo de rastreo de alto rendimiento. Concretamente, muestreamos las NSCs DDAO-SE+ con una longitud mínima de 5 a 10 píxeles. Tanto los parámetros de captura como los de análisis de imagen de nuestro protocolo están ajustados para trabajar fotografiar y analizar objetos en este rango de tamaño. Análisis de bioimagen Hemos desarrollado un flujo de trabajo de análisis de bioimagen que se ha automatizado en una macroinstrucción de ImageJ. Además, dada la importancia del tamaño de los objetos para la aplicación de esta herramienta, junto a ella proporcionamos otra macroinstrucción que permite disminuir el tamaño de las imágenes agrupando píxeles en cuadrados de 2x2, 3x3 o 4x4 que toman el valor de la media de todos los píxeles del conjunto. Una vez las imágenes tienen una resolución adecuada se puede iniciar el flujo de trabajo principal. Dado que es probable que sea necesario ajustar el conjunto de parámetros entre análisis, la macro permite modificar la configuración para adaptarse al análisis de diferentes experimentos. De hecho, la macro incluye un modo de prueba, que permite al usuario modificar los parámetros y verificar el resultado fácilmente antes de lanzar el análisis. Además, el conjunto de parámetros se puede guardar e importar en análisis futuros. Para favorecer el análisis no supervisado hemos incluido la medición de diferentes métricas para ser aplicadas en controles de calidad. Nuestro control de calidad está destinado a detectar dos tipos diferentes de imágenes inadecuadas: aquellas que están desenfocadas o contienen artefactos saturados, y aquellas que, a pesar de ser adecuadas en términos de adquisición de imágenes, contienen una monocapa incompleta. Tal y como se ha descrito previamente, el objetivo principal del ensayo es cuantificar el número de células adheridas por superficie de monocapa. Para contar el número de células adheridas, la imagen correspondiente al trazador DDAO-SE se suaviza antes de determinar las posiciones de los máximos de intensidad locales. Estos máximos se utilizan como marcadores para separar la imagen en territorios de Voronoi. Además, se aplica una segmentación por umbrales para generar una máscara binaria que puede contener varias células fusionadas en un único objeto. Estos objetos son separados utilizando operadores lógicos con los territorios de Voronoi y, finalmente, los píxeles aislados y otros objetos demasiado pequeños para ser células son eliminados de la imagen binaria. Por lo que respecta a la monocapa, dado que se ha utilizado DAPI para marcar el ADN de las células, el área de la monocapa debe estimarse a partir de los núcleos de los fibroblastos. Para ello se aplica el filtro del máximo para “rellenar” los espacios de fondo que quedan entre núcleos cercanos. A continuación se aplica una segmentación por umbrales para obtener una segmentación semántica de la monocapa. Una vez obtenidas las máscaras binarias de las células adheridas y la monocapa se utilizan para calcular el número de células adheridas y la superficie que ocupa la monocapa. Estudio: regulación de la proteólisis de N-cadherina en la SEZ por factores de nicho Dado que algunos de nuestros resultados preliminares in vivo sugerían que ADAM10 también podría estar involucrado en la escisión de la N-cadherina presente en la membrana NSC, aplicamos nuestra estrategia para abordar cuantitativamente el papel de ADAM10 en la regulación de la adhesión de las NSCs mediada por N-cadherina. Para ello, los cultivos de neuroesferas se trataron previamente con GI254023X (GIX), un potente fármaco inhibidor de ADAM10. Antes de realizar el protocolo de adhesión celular también se incluyó un control de especificidad con anticuerpos NcadBlock: la mitad de las células se incubaron con NcadBlock y la otra mitad con inmunoglobulinas de isotipo de ratón (IsoMsIgG). Tras el tratamiento, las NSCs (marcadas con DDAO-SE) se sembraron en la monocapa NC-L929 y se dejaron adherir durante un tiempo determinado antes de lavar las células no adheridas, fijarlas y teñirlas con DAPI para su posterior captura y análisis. Tal y como se esperaba, el NcadBlock redujo consistentemente la adhesión de las NSCs a la monocapa NC-L929. Con respecto a la condición experimental, en caso de que ADAM10 realmente participe en la proteólisis y el desprendimiento de la N-cadherina en las NSC, su inhibición debería provocar un incremento en los niveles de N-cadherina en la superficie celular y, por lo tanto, en una mayor adhesión. Esto fue confirmado en nuestro ensayo, ya que la condición tratada con GIX mostró un mayor recuento de células DDAO-SE-positivas adheridas por área de monocapa. CAPÍTULO 2 Antecedentes biológicos La proliferación celular y la muerte celular programada son sin duda dos de los procesos más estudiados en el campo de la biología celular. En el campo de las células madre en particular, la regulación del ciclo celular es fundamental para comprender las propiedades clave de las células madre, como su mantenimiento a través de la transición reversible entre la quiescencia y la activación o el cambio de la pluripotencia a la diferenciación. La apoptosis, por otro lado, ha surgido en los últimos años como un tema importante en el estudio de las células madre, ya que se ha encontrado que los cuerpos apoptóticos de las células circundantes pueden inducir la proliferación de células madre o que mediadores apoptóticos específicos pueden desempeñar un papel en la diferenciación de las células madre. Entre los métodos adecuados para evaluar la proliferación celular mediante análisis microscópico, los experimentos de pulso y caza con análogos de nucleósidos destacan por su fiabilidad y aplicabilidad en ensayos de rastreo. Este enfoque se basa en la detección de nucleósidos trazables incorporados al ADN mientras las células pasan por la fase S del ciclo celular. Para ello, las células se incuban con pirimidinas modificadas, que actúan como análogos de timidina, durante un breve período de tiempo (pulso). Después de eso, las células se pueden fijar y procesar inmediatamente para la detección del ADN marcado, lo que proporciona una estimación de la proliferación general en la muestra (caza). Las pirimidinas que contienen halógenos, como BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) se han utilizado durante décadas con este objetivo, lo que requiere la desnaturalización del ADN para revelar su presencia mediante inmunotinción con anticuerpos específicos. Por el contrario, la EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) puede detectarse directamente mediante una reacción “click” mediante la cual grupo alquino presente en la molécula de EdU forma un enlace covalente con una azida ligada a un fluoróforo, haciendo innecesario el uso de anticuerpos o el desenmascaramiento de antígenos por tratamiento térmico o ácido. Por esta y otras ventajas, EdU se ha convertido en los últimos años en una alternativa popular para los ensayos de rastreo. La apoptosis es una forma de muerte celular provocada por la activación de cascadas proteolíticas altamente reguladas y con características bioquímicas y morfológicas estereotipadas. Los procesos apoptóticos se dividen en dos subtipos principales, apoptosis intrínseca o extrínseca, según las vías bioquímicas implicadas en su regulación. Por un lado, la apoptosis intrínseca depende de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial, liberando proteínas mitocondriales que son responsables de la activación de la caspasa iniciadora 9. Por otro lado, la apoptosis extrínseca está mediada por dos tipos diferentes de receptores de membrana: la presencia de ligandos de receptores de muerte conduce a la activación de las caspasas iniciadoras 8 y 10, mientras que la ausencia de ligandos de receptores de dependencia conduce a la activación de la caspasa iniciadora 9. Las caspasas ejecutoras 3, 6 y 7 son efectores comunes tanto para la vía intrínseca como extrínseca, y son escindidas por las caspasas 8, 9 o 10 para iniciar la apoptosis. Debido a su papel central en las vías de señalización de la apoptosis, los efectores comunes como las caspasa 3 y 7 son biomarcadores bien establecidos para la detección de células apoptóticas y pueden detectarse fácilmente en los núcleos mediante inmunoquímica mediante una gran variedad de anticuerpos disponibles comercialmente que distinguen específicamente la forma activada de cada caspasa de su cimógeno pro-caspasa. Análisis de bioimagen Hemos desarrollado un flujo de trabajo de análisis de bioimagen para analizar un rastreo de alto contenido para la evaluación de la proliferación celular y la apoptosis. A pesar de que el flujo de trabajo se ha ensamblado en una sola macroinstrucción de ImageJ, se han diseñado flujos de trabajo adicionales para realizar pasos de preprocesamiento opcionales. Además, igual que en el capítulo anterior, este flujo de trabajo también incluye un modo pre-análisis para testar los parámetros ajustables y visualizar el resultado. Dado que el ensayo se basa en datos densitométricos, es necesario tener en cuenta que las imágenes adquiridas a través de un microscopio óptico se ven afectadas por el viñeteado, que se estima que causa una variación en la iluminación efectiva del 10-30% entre las diferentes regiones de la imagen. Para mejorar la calidad de los datos, es posible corregir las imágenes experimentales en un paso de preprocesamiento o determinar una región con una variación de iluminación mínima para excluir el resto del análisis. El flujo de trabajo incluye un paso opcional destinado a corregir la iluminación irregular utilizando la plugin BaSiC, un método retrospectivo que utiliza múltiples imágenes aprovechando la gran cantidad de imágenes que se generan en un ensayo de rastreo. El ensayo computa datos densitométricos de diferentes sondas fluorescentes que marcan moléculas localizadas total o parcialmente en los núcleos celulares pero que muestran diversos patrones de tinción. En consecuencia, la segmentación se realiza en el canal de la tinción nuclear (p.ej., DAPI). Para lograr una segmentación de núcleos precisa, el usuario puede elegir entre dos estrategias diferenciadas. Por un lado, un flujo de trabajo basado en métodos clásicos de procesamiento de imágenes que incluye algunos de los pasos más habituales en este tipo de estrategias (filtros de suavizado, métodos de segmentación por umbrales y operaciones de morfología matemática). Por otro lado, un enfoque de aprendizaje profundo (DL, del inglés, deep learning) utilizando el modelo ve