Engineering Antisense Oligonucleotides for Site-directed RNA Editing with Endogenous ADAR

With several clinical approvals, the field of oligonucleotide therapeutics has come of age in the last years. Simultaneously, the discovery of the CRISPR-Cas system has revolutionized manipulation of genetic information in cells and organisms. However, therapeutic application of DNA editing with CRISPR suffers from the unresolved safety issues due to unpredictable potential off-target effects. More recently, several approaches have evolved to escape the risk of permanent DNA damage by targeting RNA instead. Yet, all approaches for site-directed RNA editing require the ectopic expression of a protein in addition to the expression or application of an RNA molecule and suffer from partially severe off-target RNA editing. In this thesis, it was sought to combine the advantages of site-directed RNA editing with the advances of oligonucleotide therapeutics. Therefore, antisense oligonucleotides to harness the endogenous RNA editing enzyme ADAR for site-directed RNA editing were designed, an approach we refer to as RESTORE (recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing). Various chemical modifications resulted in precise and efficient editing in the 3’UTR and ORF with a superior off-target editing profile compared to all other existing RNA editing approaches. The applicability of RESTORE could be demonstrated in a wide panel of human cell lines and with even better editing yields of up to 80% in the ORF of human primary cells. Furthermore, pathogenic mutations found in severe genetic disorders as Rett syndrome, alpha-1-antitrypsin deficiency and Hurler syndrome could be edited. To demonstrate the therapeutic potential of RESTORE, the IDUA W402X mutation was edited in primary fibroblasts donated from two Hurler syndrome patients. Importantly, the wild-type phenotype could be partially restored and an enzyme activity of up to 6-fold higher than that of the much milder Scheie syndrome could be reached. Finally, to transfer this promising approach to in vivo applications, the antisense oligonucleotides were further improved with chemical modifications, enhancing stability in serum and cerebrospinal fluid. Moreover, this made unassisted gymnotic uptake of the antisense oligonucleotides into primary cells possible. Together with the successful recruitment of murine ADARs, this paves the way to in vivo applications and the development of RESTORE as a new class of oligonucleotide therapeutics.Mit mehreren klinischen Zulassungen ist das Gebiet der Oligonukleotid-Therapeutika in den letzten Jahren erwachsen geworden. Gleichzeitig hat die Entdeckung des CRISPR-Cas-Systems die Manipulation genetischer Informationen in Zellen und Organismen revolutioniert. Die therapeutische Anwendung der DNA-Editierung mit CRISPR leidet jedoch unter den ungelösten Sicherheitsproblemen aufgrund unvorhersehbarer potenzieller Nebenwirkungen durch ungewollte DNA-Schädigungen. In jüngerer Zeit wurden verschiedene Ansätze zur ortsspezifischen RNA-Editierung entwickelt, um dem Risiko einer dauerhaften DNA-Schädigung zu entgehen, indem stattdessen RNA als Eingriffspunkt gewählt wurde. Alle Ansätze für die ortsspezifische RNA-Editierung erfordern jedoch zusätzlich zur Expression oder Anwendung eines RNA-Moleküls die ektopische Expression eines Proteins und leiden unter teilweise deutlicher RNA-Editierungen außerhalb des Zielbereichs, sogenannter Off-Target Editierungen. In dieser Arbeit wurde versucht, die Vorteile der ortsgerichteten RNA-Editierung mit den Fortschritten der Oligonukleotid-Therapeutika zu kombinieren. Aus diesem Grund wurden Antisense-Oligonukleotide entwickelt, um das endogene RNA-Editing-Enzym ADAR für die ortsspezifische RNA-Editierung zu nutzen. Dieser Ansatz wird als RESTORE bezeichnet (Rekrutierung von endogenem ADAR für spezifische Transkripte für Oligonukleotid-vermitteltes RNA-Editing). Verschiedene chemische Modifikationen führten zu einer präzisen und effizienten Editierung im 3'UTR und ORF mit einem überlegenen Off-Target-Editierungsprofil im Vergleich zu allen anderen bestehenden RNA-Editierungsansätzen. Die Anwendbarkeit von RESTORE konnte in einer breiten Palette von humanen Zelllinien und mit noch besseren Editierungsausbeuten von bis zu 80% im ORF von humanen Primärzellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnten pathogene Mutationen von schweren genetischen Störungen wie dem Rett-Syndrom, dem Alpha-1-Antitrypsin-Mangel und dem Hurler-Syndrom editiert werden. Um das therapeutische Potenzial von RESTORE zu demonstrieren, wurde die IDUA W402X-Mutation in primären Fibroblasten von zwei Hurler-Syndrom Patienten editiert. Wichtig ist, dass nicht nur auf RNA-Ebene der Wildtyp-Phänotyp teilweise wiederhergestellt werden konnte, sondern auch eine bis zu 6-fach höhere Enzymaktivität als beim viel milderen Scheie-Syndrom erreicht werden konnte. Um diesen vielversprechenden Ansatz auf in-vivo Anwendungen zu übertragen, wurden die Antisense-Oligonukleotide mit chemischen Modifikationen weiter stabilisiert, und es konnte eine verbesserte Stabilität in Serum und Cerebrospinalflüssigkeit erreicht werden. Darüber hinaus ermöglichte dies die freie „gymnotische“ Aufnahme der Antisense-Oligonukleotide in Primärzellen ohne weitere Unterstützung. Zusammen mit der erfolgreichen Rekrutierung von Maus-ADARs ebnet dies den Weg für in vivo Anwendungen und die Entwicklung von RESTORE als neue Klasse von Oligonukleotid-Therapeutika