Charakterisierung der PKA Regulation im NF1 Signalweg

7 Zusammenfassung Zusammenfassung Im Rahmen der Diplomarbeit sollten zwei Fragestellungen bearbeitet werden. Zum einen sollte untersucht werden, ob die beiden Kelch/β-Prpopeller Proteine Gβ und GβL mit einer Domäne, die im C-terminalen Bereich des Proteins Neurofibromin lokalisiert ist, interagieren. Zum anderen sollte erforscht werden, welchen Einfluss die Signalwege von p38, Protein Kinase A und Ras, auf die Osteoblastendifferenzierung ausüben, da in Versuchen gezeigt werden konnte, dass diese Signalwege in NF1-defizienten Osteoblasten, die eine Störung der Differenzierung aufweisen, aktiviert waren. Um eine mögliche Protein Interaktion zwischen Neurofibromin und Kelch/ß-Propeller-Proteine zu analysieren, war die Durchführung einer Co-Imunopräzipitation von Fragmenten des Nf1-Gens mit den potentiellen Interaktionspartnern geplant. Allerdings gelang es im Rahmen der Diplomarbeit nicht, das Nf1-Fragment mit der potentiellen Kelch/ß-Propeller Bindedomäne in vitro zu exprimieren. Es wird vermutet, dass dies auf eine posttranskriptionelle Degradation des Fragments zurückzuführen ist. Um den Einfluss der Signalwege von Ras, p38 und PKA auf die Osteoblastendifferenzierung zu analysieren, wurde das retrovirale RCAS-Virus-System verwendet. Mithilfe dieses Systems konnten die entsprechenden Signalwege im primären Chicken-Bonemarrow (Osteoblasten) Zellsystem aktiviert werden. Durch eine Analyse der Mineralisierung der Kulturen und der Expression spezifischer Markergene über quantitative Realtime PCR, konnte ein hemmender Effekt des MKK6/p38-Signalwegs und des PKA Signalweges gefunden werden. Eine Inhibierung des Ras-MAPK Signalwegs auf dem Level von MEK (MAP kinase/ ERK Kinase) durch den Inhibitor PD98059 bewirkte eine deutliche Steigerung der Osteoblastendifferenzierung. Dieser Effekt war so stark, dass er die inhibierenden Effekte eines aktivierten MKK6/p38 und PKA Signalwegs kompensierte. Es scheint, dass MEK eine wichtige regulatorische Funktion bei der Osteoblastendifferenzierung einnimmt. Durch Mikroinjektion von RCAS-Viren (die den PKA Signalweg aktivieren) in Hühner- Extremitäten konnte in vivo ein Block der Mineralisierung und eine deutliche Steigerung der Initialen bei gleichzeitiger Hemmung der terminalen Knorpeldifferenzierung, erreicht werden. Untersuchungen im primären Chicken-Micromas-System konnten zeigen, dass es durch Aktivierung des PKA-Signalweges zu einer Steigerung der initialen und einer Verzögerung/Hemmung der terminalen Knorpeldifferenzierung kommt. Dies kann mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sox9 durch PKA in Verbindung gebracht werden