From catalysis to contact-dependent growth inhibition system: multiple functions of bacterial O-acetylserine sulfhydrylase

CysK, uno degli isoenzimi di O-acetilserina sulfidrilasi (OASS) presenti in piante e batteri, è un enzima studiato da molto tempo ed il suo ruolo fisiologico nella sintesi della cisteina è stato ben definito. Recentemente sono state scoperte altre funzioni apparentemente non collegate alla sua funzione enzimatica (moonlighting). Una di queste è l’attivazione di una tossina ad attività tRNAsica, CdiA-CT, coinvolta nel sistema di inibizione della crescita da contatto (CDI) di ceppi patogeni di E. coli. In questo progetto abbiamo studiato il ruolo di CysK nel sistema CDI e la formazione di complessi con due differenti partner proteici: CdiA-CT e CysE (serina acetiltransferasi, l’enzima che catalizza la reazione precedente nella biosintesi della cisteina). I due complessi hanno le stesse caratteristiche spettrofluorimetriche e affinità molto simili, ma la cinetica di raggiungimento dell’equilibrio per il complesso tossina:CysK è più lenta che per il complesso CysE:CysK (cisteina sintasi). In entrambi i casi la formazione veloce di un complesso d’incontro è seguita da un riarrangiamento conformazionale che porta alla formazione di un complesso ad alta affinità. L’efficienza di formazione del complesso cisteina sintasi è circa 200 volte maggiore rispetto al complesso CysK:tossina. Una differenza importante, oltre alla cinetica di formazione dei complessi, è la stechiometria di legame. Infatti mentre CysE riesce a legare solo uno dei due siti attivi del dimero di CysK, nel complesso con CdiA-CT entrambi i siti attivi dell’enzima risultano essere occupati. Le cellule isogeniche esprimono un peptide inibitore della tossina (CdiI), e sono quindi resistenti all’azione tRNAsica. Tuttavia, siccome CdiI non altera la formazione del complesso CdiA-CT:CysK, CdiA-CT può esercitare comunque un ruolo nel metabolismo della cisteina e quindi nella fitness dei batteri isogenici, attraverso il legame e l'inibizione di CysK e la competizione con CysE. La via biosintetica della cisteina, un precursore di molecole riducenti, risulta essere molto importante per i batteri soprattutto in condizioni avverse come all’interno dei macrofagi nelle infezioni persistenti. Perciò questa via metabolica è di interesse per lo sviluppo di nuovi antibiotici, e in particolare le due isoforme dell’OASS negli enterobatteri, CysK e CysM, sono potenziali target per lo sviluppo di nuove molecole ad azione antibatterica. Partendo dall’analisi delle modalità di interazione con CysK del suo partner ed inibitore fisiologico, CysE, si è studiato dapprima l’interazione di pentapeptidi che mimassero la regione C-terminale di quest'ultimo, e in base ai dati ottenuti sono stati sviluppati piccoli ligandi sintetici. La struttura generale di questi composti è costituita da un gruppo acido ed un gruppo lipofilo, separati da un linker ciclopropanico che mantiene questi due gruppi in conformazione trans, ottimale per l’interazione col sito attivo dell’enzima. Sulla base di queste considerazioni, di docking in silico e di dati sperimentali ottenuti con la tecnica dell’STD-NMR e con saggi di binding spettrofluorimetrici, si è potuta realizzare una analisi di relazione struttura-attività che ha portato via via all’ottimizzazione dei ligandi. Il composto più affine che è stato finora ottenuto ha una costante di dissociazione nel range del nanomolare per entrambe le isoforme, ed è un ottimo punto di partenza per lo sviluppo di nuovi farmaci.CysK, one of the isoenzymes of O-acetylserine sulfhydrylase (OASS) present in plants and enterobacteria, has been studied for a long time and its physiological role in cysteine biosynthesis has been well established. Recently, other functions of this enzyme, apparently not related to its enzymatic activity, were discovered (moonlighting). One of these is the activation of a tRNAse toxin, CdiA-CT, involved in a contact-dependent growth inhibition system (CDI) in pathogenic strains of E. coli. In this project we have studied the role of CysK in the CDI system and the mechanism of complex formation with two different proteins: CdiA-CT and CysE (serine acetyltransferase, the enzyme that precedes OASS in cysteine biosynthetic pathway). CysE and CdiA-CT bind CysK with comparable affinities and likely the same binding mode, the insertion of their C-terminal sequence into CysK active site. However, the kinetics and the stoichiometry of complex formation are markedly different. The attainment of equilibrium is two orders of magnitude slower for toxin:CysK complex. As for binding stoichiometry CysE can bind only one of the two active sites of the CysK dimer, while CdiA-CT can occupy both active sites of the enzyme. Isogenic cells express a peptidic inhibitor of the CdiA-CT toxin (CdiI), which doesn’t affect complex formation with CysK, but prevents the activation of toxin. Therefore, in this cells CdiA-CT could play a role in cysteine metabolism and thus in bacterial fitness, by inhibiting CysK upon toxin:CysK complex formation and by competing with CysE. The biosynthetic pathway of cysteine, a precursor of reducing agents, is very important for bacteria, especially in adverse conditions such as within macrophages during persistent infections. Therefore, this metabolic pathway of interest for the development of new antibiotics. In particular, the two isoforms of OASS in enterobacteria, CysK and CysM, have been validated as excellent targets for the development of new antibacterial molecules. Starting from the analysis of the mechanism of interaction with the physiological inhibitor of CysK, CysE, at first we have investigated the interaction between CysK and pentapeptides that mimic CysE C-terminal region. In a second stage, we exploited the acquired information to develop small synthetic ligands. The general structure of these compounds is constituted by an acidic and a lipophilic group, separated by a cyclopropane linker which keeps the two groups in a trans conformation. Only one enantiomer is responsible for the interaction with the active site of the enzymes. Based on these considerations, on docking analysis in silico and on experimental data obtained from STD-NMR and fluorimetric binding assays, we carryied out a preliminary structure-activity relationship analysis that drove further ligand optimization steps. The most active compound obtained so far has a dissociation constant in the low nanomolar range for both isoforms, an excellent starting point for the development of new drugs