Caracterización de las funciones del factor remodelador de cromatina CHD8 en activación transcripcional y progresión del ciclo celular

Trabajo realizado en el Departamento de Biología Molecular, CABIMER, para optar al grado de Doctor en Biología por la Licenciada Elena Mª Vázquez Chávez, siguiendo el programa de doctorado de Biología Molecular y Biomedicina de la Universidad de Sevilla.En esta tesis se han abordado dos objetivos principales: la regulación de la estabilidad de la proteína remodeladora de la cromatina CHD8 y la función transcripcional de esta proteína en la progresión del ciclo celular. En cuanto al primer objetivo de esta tesis se ha mostrado que CHD8 interacciona con las chaperonas HSP90 y HSP70 y que la inhibición de HSP90 provoca una rápida bajada en los niveles de la proteína. Esto sugiere que CHD8 es una proteína cliente de HSP90 y por tanto que HSP90 podría estar regulando su plegamiento. Además, diversos agentes que alteran la estabilidad química y el plegamiento de las proteínas (metanol, DTT, arsenito sódico) provocan una disminución en los niveles de la proteína CHD8. Al menos en el caso del estrés oxidativo inducido por arsenito sódico, se determinó que la disminución es a nivel post-transcripcional y no es mediada por el sistema ubiquitín-proteosoma. Asimismo, se ha demostrado que un proceso apoptótico inducido por TRAIL, etopósido o estaurosporina no provoca la disminución del nivel de proteína CHD8. En el segundo objetivo de esta tesis, se ha puesto de manifiesto una función esencial para CHD8 en la progresión del ciclo celular. La decisión de entrar en fase S para replicar el DNA es probablemente uno de los procesos más controlados en la célula. Por lo tanto, la represión de los genes implicados en proliferación durante las fases G0 y G1 temprana del ciclo celular, así como, la activación de genes específicos de fase S, son procesos estrictamente controlados, que se encuentran des-regulados en la mayoría de los cánceres. Los componentes clave de la regulación transcripcional del ciclo celular son las proteínas de la familia de factores de transcripción E2F. En células quiescentes, las proteínas E2F represoras están asociados con proteínas de la familia Retinoblastoma para mantener la represión de los genes dianas de E2F implicados en la entrada en la fase S del ciclo celular. Tras estimulación mitogénica, la fosforilación secuencial de las proteínas de la familia de Retinoblastoma por los complejos CDK-ciclinas resulta en la pérdida de la función Retinoblastoma, la liberación de E2F represores y la acumulación libre de los E2F activadores recién sintetizados. La activación de la transcripción de los genes diana de E2F requiere grandes cambios en la conformación de la cromatina. En conjunto, estos eventos inician un programa transcripcional que conduce a las células hasta fase S. En esta tesis, se ha demostrado que CHD8 es necesario para que células quiescentes re-inicien el ciclo y progresen a través de fase S y G2/M tras la re-adición de suero. El silenciamiento de CHD8 en estas condiciones provoca un retraso de unas 8 horas en la progresión de ciclo celular tras la estimulación con suero y una parada del ciclo celular en G1 en células con un crecimiento exponencial. En consonancia con esta función en proliferación, se ha encontrado que CHD8 se une rápidamente en respuesta a suero al promotor de MYC y a los promotores de cuatro genes de transición G1/S (CCNA2, CDC6, CCNE2, BRCA2), pero no en células quiescentes. En concordancia con esto, CHD8 es necesario para la expresión de estos genes.Asimismo, se ha demostrado que CHD8 es necesario para la expresión inmediata de genes de inducción temprana en respuesta a suero. También se muestra que CHD8 interacciona con E2F1 y que la asociación de E2F1 a estos promotores depende de CHD8. Sin embargo, el reclutamiento de CHD8 es independiente de este factor. Además, el silenciamiento de CHD8 impide la re-entrada y progresión del ciclo celular promovida por la sobreexpresión de E2F1 en células privadas de suero, destacando el papel esencial de CHD8 en la activación transcripcional dependiente de E2F. Por otro lado, el reclutamiento de los complejos de histona metiltransferasas MLL/SET1 a estos promotores así como el nivel de di- y tri- metilación en H3K4 también se ve afectado en condiciones de silenciamiento de CHD8. Por último, se ha puesto de manifiesto una interacción de CHD8 con ELK1 y los componentes del complejo SWI/SNF BRG1, BAF170, BAF155 y SNF5, proteínas que desempeñan una función bien caracterizada en la regulación transcripcional del ciclo celular dependiente de la ruta E2F-Retinoblastoma en respuesta al estímulo mitogénico. Como conclusión final, CHD8 es esencial para la entrada en ciclo de células quiescentes y para la posterior progresión del ciclo celular en respuesta a suero, favoreciendo la transición de G1 a S, ya que promueve la transcripción de genes de inducción temprana y de genes de transición G1/S.Peer Reviewe