Nuevos mecanismos transformantes de MYC: inducción de SKP2 y degradación de p27

Tesis Doctoral presentada por Gabriel Bretones Sánchez para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Cantabria, y realizada en el Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC) y el Departamento de Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria (Santander).[ES]: [Introducción]: MYC es uno de los oncogenes más frecuentemente desregulados en cáncer humano. A través de su papel como factor de transcripción, MYC regula la expresión de cientos de genes que participan en diversas funciones celulares como la regulación del ciclo celular, la diferenciación y el metabolismo. La sobreexpresión de MYC, a los niveles encontrados en las células cancerosas, es suficiente para producir la entrada en fase S de células quiescentes, para acelerar la tasa de proliferación celular, y para prevenir la salida del ciclo celular. p27 (KIP1) es un inhibidor de CDKs que restringe la transición de las células a través de la fase G1-S y detiene la progresión del ciclo celular. En la mayoría de los tumores humanos, bajos niveles de p27 suelen estar asociados con un peor pronóstico de la enfermedad. Los niveles de MYC y p27 se correlacionan inversamente en muchos tumores, y se ha demostrado en diversos modelos celulares, que la sobreexpresión MYC antagoniza el efecto antiproliferativo de p27. Sin embargo, los mecanismos que median este antagonismo no se comprenden aún del todo. Por ello, en este trabajo hemos decidido profundizar, y en su caso encontrar mecanismos moleculares que puedan explicar el antagonismo entre MYC y p27 en diferentes contextos experimentales. [Resultados]: Previamente, utilizando tecnología de microarrays, encontramos que la activación de MYC en las células K562 regulaba la expresión de SKP2 a nivel de ARNm (Acosta et al., 2008). SKP2 es una proteína F-Box del complejo ligasa de ubiquitinas SCF, que tiene a p27 como uno de sus principales sustratos para la proteólisis. SKP2 se encuentra frecuentemente sobreexpresado en cáncer humano, asociado con la progresión tumoral e inversamente correlacionado con p27. De hecho, la actividad oncogénica de SKP2 se atribuye principalmente a la degradación de p27. Utilizando diferentes sublíenas celulares con expresión condicional de MYC derivadas de la línea de leucemia humana K562, hemos encontrado que MYC induce la expresión de SKP2 a nivel de ARNm (por RT-qPCR) y de proteína (por inmunoblot). Esta inducción de SKP2 era independiente de la estimulación de la proliferación mediada por MYC. Por otro lado, el silenciamiento de MYC mediante siRNA dio lugar a la disminución de SKP2 en células K562. Además, encontramos que MYC regulaba la expresión de SKP2 en otras dos líneas celulares con expresión condicional de MYC como línea linfoide humana (P493.6) y las células epiteliales de visión (TM1); y que los niveles de SKP2 estaban notablemente disminuidos en fibroblastos de rata deficientes en MYC (células HO.15.19). MYC fue capaz de incrementar la expresión de SKP2 a nivel de ARNm en presencia de un inhibidor de la síntesis de proteínas en células K562, sugiriendo que MYC era un activador directo de SKP2. Mediante ensayos luciferasa observamos que MYC activaba el promotor de SKP2 humano y mediante experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina demostramos que MYC se unía a la región reguladora 5´ del gen SKP2 humano que incluía dos cajas E, confirmando que SKP2 era un nuevo gen diana de MYC. Dado que la línea celular K562 deriva de una leucemia mieloide crónica humana (LMC), se estudiaron un grupo de 39 muestras de CML y se encontró una correlación entre los niveles de MYC y SKP2 a nivel de ARNm. Además, utilizando las bases de datos Oncomine y GeneSapiens encontramos que la expresión de MYC y SKP2 se correlaciona también en otras dos neoplasias hematológicas como la leucemia mieloide aguda y el linfoma. Por otra parte, se observó que,en las células K562, MYC promovía la fosforilación de p27 en la treonina 187 a través de la inducción de la ciclina A y la actividad quinasa asociada a dicha ciclina. Esta fosforilación es requerida para el reconocimiento de p27 por parte del complejo SCF SKP2. Además se encontró que, en fibroblastos embrionarios de ratón, MYC era capaz de promover dicha fosforilación independientemente de la presencia de CDK2 o de ciclinas E. La inducción de SKP2 por MYC se correlacionaba con la disminución de los niveles de p27 en las sublíneas derivadas de K562. El silenciamiento de SKP2 mediante siRNA dio como resultado el aumento de p27 a nivel de proteína, dando lugar a una disminución de la tasa proliferativa de las células K562 y a una reducción de la capacidad tumorogénica de estas células en xenoinjertos en ratones desnudos. El silenciamiento de SKP2 no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad o la actividad de MYC. Finalmente, mediante cromatografía de filtración en gel, observamos que p27 se acumulaba en forma libre cuando éste se sobreexpresaba a altos niveles dentro de las células K562, lo que se asociaba con un bloqueo total de la proliferación y que la desaparición de p27 en forma libre se correlaciona con el estímulo proliferativo mediado por MYC. [Conclusión]: En conjunto, nuestros datos muestran que, al menos en células K562, MYC orquesta o dirige una serie de mecanismos que incluyen la regulación del oncogen SKP2 y la ciclina A, la estimulación de la actividad quinasa de las CDKs asociadas a la ciclina A y la inducción de la fosforilación de p27 en Thr-187, para promover la degradación final de p27. A través de estos mecanismos, las células malignas que sobreexpresan MYC adquirirían una ventaja proliferativa con respecto a las células no transformadas.[EN]: [Introduction]: MYC is one of the most frequently de-regulated oncogenes in human cancer. Through its role as a transcription factor, MYC regulates the expression of hundreds of target genes, involved in a wide range of cellular functions, such as cell cycle regulation, differentiation and metabolism. Expression of MYC at levels found in cancer cells is sufficient to drive primary quiescent cells into S phase, to accelerate rates of cell proliferation, and to prevent withdrawal from the cell cycle. p27 (KIP1) is a CDK inhibitor that restricts the transition of cells through the G1 and S phases of the cell cycle and arrests cell cycle progression. p27 levels are frequently down-regulated in human cancer and patients with tumors having low or undetectable levels of p27 protein have a very poor outcome. The levels of MYC and p27 inversely correlate in many human tumors, and it has been demonstrated in cell culture models that MYC overexpression antagonizes the antiproliferative effect of p27. However the mechanisms that mediated this antagonism are not understood at all. For this purpose, in the present study we have investigated the molecular mechanisms that underline the antagonism between MYC and p27 in different experimental contexts. [Results]: Previously, using microarray technology we found that the activation of MYC up-regulates SKP2 mRNA expression in K562 cells (Acosta et al., 2008). SKP2 is an F-Box protein of the SCF ubiquitin-ligase complex, being p27 as one of its major substrates for proteolysis. SKP2 gene is frequently overexpressed in human cancers, inversely correlated with p27 and associated with tumor progression. We have used K562 human leukemia cell lines whit conditional MYC expression and we have found that MYC induces SKP2 expression at the mRNA (by RT-qPCR) and protein levels (by immunoblot). This SKP2 up-regulation was independent of MYC-induced cell proliferation. siRNA-mediated MYC silencing also resulted in SKP2 down-regulation in K562 cells. Moreover, MYC regulated SKP2 in a human lymphoid (P493.6) and mink epithelial (TM1) cell lines with conditional MYC expression and SKP2 was under-expressed in MYC null rat fibroblasts (HO.15.19 cells). MYC was able to up-regulate SKP2 mRNA expression in the presence of a protein synthesis inhibitor in K562 cells suggesting that MYC was a direct activator of SKP2. Luciferase assays showed that MYC activated human SKP2 promoter and chromatin immunoprecipitation experiments demonstrated that MYC bound to a 5´regulatory region of human SKP2 gene that includes two E-boxes, confirming that SKP2 was a new MYC target gene. Given that K562 cell line derives from human chronic myeloid leukemia (CML), we studied a cohort of 39 CML samples and we found a correlation between MYC and SKP2 mRNA levels. In addition, using Oncomine and GeneSapiens databases we found that MYC and SKP2 mRNA expression also correlates in two other hematological malignancies as acute myeloid leukemia and lymphoma. On the other hand,we observed that, in K562 cells, MYC promoted p27 phosphorylation at threonine 187 through the induction of cyclin A and the kinase activity associated to this cyclin. This phosphorylation is required for p27 recognition by the SCF SKP2 ubiquitin ligase complex. In addition, we found that, in mouse cells, MYC was able to promoting such phosphorylation independently of CDK2 or E-type cyclins. Importantly, the MYC-induced expression of SKP2 correlated with decreased p27 protein levels in K562-derived sublines. siRNA-mediated silencing of SKP2 resulted in increased p27 protein levels, led to a decrease of the proliferative rate of K562 cells and reduced the tumorigenic capacity of these cells in xenographs in nude mice. Interestingly, SKP2 silencing had no effect on MYC stability or activity. Finally, using gel filtration chromatography we found that p27 accumulates as free form when it was expressed at high levels in K562 cells and this was associated with a total proliferation block. The disappearance of p27 as free form correlates with MYC-mediated proliferative stimulus. [Conclusion]: Altogether, our data shows that, at least in human leukemia K562 cells, MYC orchestrates several mechanisms including up-regulation of the SKP2 oncogene and cyclin A, stimulation of CDK kinase activity associated to cyclin A and induction of p27 phosphorylation at Thr 187, to promote p27 down-regulation. Through these mechanisms, malignant cells overexpressing MYC acquire a proliferate advantage over normal non transformed cells.La financiación necesaria para la realización de esta Tesis doctoral ha sido aportada por el Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2008-01581 y SAF2011-23796) del Instituto Carlos III (RD06/0020/0017). Parte de los experimentos presentados en la Memoria de Doctorado fueron realizados por el Ldo. Gabriel Bretones Sánchez en el laboratorio del Dr. Oriol Bachs en el Departamento de Biología Celular de la Facultad de Medicina de Barcelona (Barcelona) durante una estancia de cuatro meses financiada por el Ministerio de Educación y Ciencia a través de su programa de ayudas para estancias cortas en otros centros de investigación. El autor de esta Tesis ha disfrutado de una beca predoctoral de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2006-12120) (2006-2010) concedida por el Ministerio de Educación y Ciencia y de un contrato de nueve meses por la Universidad de Cantabria.Peer Reviewe