Estudo da produção da enzima invertase extracelular por Kluyveromyces bulgarius

Resumo: O principal objetivo deste trabalho, foi estudar a produção da enzima invertase por Kluyveromyces bulgaricus utilizando diferentes processos de fermentação com células livres e imobilizadas. Estudou-se igualmente a influência dos substratos sacarose, glicose e frutose na cinética de crescimento domicrorganismo e de produção da enzima, além de procurar caracteriza-la cineticamente. As fermentações foram realizadas á temperatura de 30°G e aeração entre 0,2 a 0,3 vvm, sendo que dos processos estudados, os melhores resultados foram obtidos- para reator contínuo com células imobilizadas, com volume liquido de 530 ml, utilizando melaço como fonte de carbono e agua de maceração demilho como fonte de nitrogênio. Os valores de atividade enzimática, produtividadee rendimento para os diferentes processos foram: para o processo batelada simples respectivamente 9,17 U.I/ml, 0,19 U.I/ml.h e 424,34 U.I/g ART; para processo batelada alimentada 11,0 U l/mi, 1,3 U.I/ml.h e 883,66 Ul/g ART; para processo em reator contínuo duplo estágio 32,0 U.I/ml, S,30 U.I/ml.h e 1749,60 U.I/g ART epara reator contínuo com células imobilizadas 97,3 U.I/ml , 5,74 U.I/ml.h e 5322,97 U.I/g AKT. Para o estudo da influência do substrato na produção da enzima, verificou-se tratar-se de enzima constitutiva e que a produção é inibida pela presença em excesso de sacarose, glicose e frutose. Através da técnica de perturbação por degrau, em fermentação contínua determinou-se µmax constante de saturação Ks para o microrganismo. As constantes cinéticas de crescimento µmax (velocidade específica de crescimento máxima) e Ks ( constante de saturação ) foram deter terminadas em fermentação contínua. Verificou-se que para qualquer dos substratos utilizados (sacarose, glicose e frutose) µmax foi aproximadamente constante e igual a 0,24 h-1, enquanto que Ks foi 1,4*10-4, 1,15*10-3 e si 1,77*10-3 mol/l, respectivamente para sacarose, glicose e frutose. Os valores das constantes cinéticas µmax e Ks para a produção da enzima nos diferentes substratos foram: 3099,51 U.I/gcel . h e 0,0181 mol/l; 5264,8 U.I/g h e 0,0023 mol/l e 14S0.99 U.I/g . h e 0.0097 mol/l para a sacarose, glicose e frutose respectivamente. Quanto a caracterização da enzima foram encontrados os valores da energia de desativação para a enzima precipitada com álcool e após passsagem por coluna de DEAE- celulose, 61043 cal/g.mol e 93861,9 cal/g.mol respectivamente. Para a enzima bruta (após precipitação com álcool) foram encontrados os valores de Km igual 0,0662 mol/l e Vmax igual a 2037 U.I/ml.Abstract: The main objective of this work was to study the production of enzyme invertase by Kluyveromyces bulgaricus using immobilized cell and free cell fermentations. Parallel with this, it was studied the influence of the substrates sucrose, glucose and fructose on the kinetics of cell growth and enzyme production. The fermentations were carried out at a temperature of 30°C and with aeration at a level between 0.2 and 0.3 vvm. The best results were obtained utilizing the continuous reactor operating with immobilized cells and a liquid volume of 530 ml. Molasse from sugar cane juice was the carbon source and the nitrogen source was the corn steep liquor. The values found f or enzyme production, and productivity and yield for the various process studied were as follows: for the simple batch process respectively 9.17 U.I./ml, 0.19 U.I./ml.h and 424.34 U.I./g ART; for fed batch 11.0 U.I./ml, 1.3 U.I/ml.h and 883.66 U.I/g ART; for 2 stage continuous culture 32.0 U.I.Xml, 5.30 l).I./ml.h and 1749.60 U.I/g ART; and for continuous culture with immobilized cells 97.3 U.l./ml, 5.74 U.I./ml.h and 5322.97 U.I./g ART. The study of influence on enzyme production confirmed that the enzyme is produced constitutively and is inhibited by excess sucrose, glucose or fructose. Using the technique of graded perturbation in continuous culture, values for umax (specific growth rate) and Ks (Saturation constant) of the microorganism were determined, umax found to be approximately constant at 0,24 h-1 while Ks was found to be1.4x10-4, 1.15x10-9 and 1.77x10-9 mol/l for sucrose, glucose and fructose respectively. The kinetcs constant umax and Ks for enzyme production were: 3099.51 U.I/gcells.h and 0.0181 mol/l; 5264.8 U.I/gcells.h and 0.0023 mol/l, and 1450.99 U.I./gcells .h and 0.0097 mol/I for sucrose, glucose and fructose respectively. With respect the characterization of the enzyme itself, the deactivation of the energy of the purified enzyme after precipitation with ethanol was 61043 cal/gmol wile after further purification using a DEAE-celulose column was 93861.9 cal/mol For the raw enzyme (after simpy precipitating with ethanol) a Km value of 0.0662 mol/l and Vmax value of 2037U.I./ml