Sintese of oligossacarideos in half watery organico and using inulinase exempts and immobilized produced for Kluyveromces marxianus ATCC 16045 and NRRL Y-757.

Resumo: Atualmente cresce a procura por alimentos que tragam benefícios à saúde humana.Assim, os oligossacarídeos vêm sendo incluídos na dieta acarretando vários benefícios. A contribuição mais importante desses açúcares está associada à melhoria na composição daflora intestinal e conseqüentemente ao aumento do número de bifidobactérias. Este trabalho teve como objetivo a caracterização da inulinase, de Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 e NRRL Y-7571, e a otimização da conversão da sacarose em frutooligossacarídeos em meio orgânico e aquoso, utilizando a enzima nas formas livre e imobilizada. A síntese dos frutooligossacarídeos foi realizada em reatores encamisados. A identificação e a quantificação dos mesmos foram feitos através da cromatografia de íons. A enzima inulinase da linhagem ATCC 16045 apresentou como temperatura ótima de reação 55oC para a enzima livre e imobilizada, independentemente da porcentagem de solvente utilizada. A temperatura de maior estabilidade foi de 50oC, tanto para enzima livre quanto para a imobilizada, sendo a meia vida em torno de 12 horas para a livre e 38 horas para a imobilizada a 50°C. Determinou-se o pH 4,8 e 4,4 como sendo os ótimos de reação para a enzima na forma livre e imobilizada, respectivamente, independentemente da porcentagem de solvente utilizada. Quanto ao pH de estabilidade, obteve-se para enzima livre 4,4, 4,8 e 4,4 em 25, 50 e 70% de solvente, respectivamente. Enquanto que para a imobilizada o pH de maior estabilidade foi 4,8 independentemente da porcentagem de solvente. No estudo cinético os valores para as constantes cinéticas foram Km 0,016, 0,17 e 0,13 M, e Vmax 10,6, 34,7 e 23,7 mol/(min.L), para 25, 50 e 70% de solvente, respectivamente, para a enzima livre. Enquanto que para a enzima imobilizada os valores de Km foram 0,0035, 0,006 e 0,025 M e Vmax 39, 60 e 86 mol/(min.L), para 25, 50 e 70% de solvente, respectivamente. A enzima inulinase da linhagem NRRL Y-7571 apresentou como temperatura ótima de reação 50oC para a enzima livre independentemente da porcentagem de solvente utilizada. Enquanto que para a imobilizada o ótimo foi de 55, 60 e 55oC, para 25; 50 e 70% de solvente, respectivamente. A temperatura de maior estabilidade foi de 50oC, tanto para enzima livre quanto para a imobilizada, sendo o tempo de meia vida em torno de 15 horas para a livre e em torno de 19 horas para a imobilizada a 50°C. Determinou-se o pH 4,8 como sendo o ótimo de reação para a enzima tanto na forma livre como imobilizada, independentemente da porcentagem de solvente utilizada. Quanto ao pH de estabilidade, obteve-se para livre 4,4, 4,4 e 4,0 e para a imobilizada foi de 4,0, 4,0 e 4,4 em 25, 50 e 70% de solvente, respectivamente. No estudo cinético os valores para as constantes cinéticas foram Km 0,026, 0,038 e 0,08 M, e Vmax 11,3, 21,2 e 35,2 mol/(min.L), para a livre. Enquanto que para a imobilizada os valores de Km foram 0,006, 0,002 e 0,01 M e Vmax 22,9, 27 e 33,2 mol/(min.L), para 25, 50 e 70% de solvente, respectivamente. Os experimentos foram conduzidos através de planejamento experimental e análise de superfícies de respostas, onde estudou-se o efeito do pH, temperatura, relação solvente/tampão, porcentagem de sacarose, PEG (polietileno-glicol) e enzima sobre a máxima conversão da sacarose em frutooligossacarídeos (YFOSs) e a produtividade. A partir da linhagem ATCC 16045 em meio orgânico as máximas YFOSs foram de 13,5 e 18,7%, utilizando a enzima livre e imobilizada, respectivamente. Enquanto que em meio aquoso as máximas YFOSs obtidas foram de 11,9 e 15,3%, utilizando a inulinase livre e imobilizada, respectivamente. A partir da linhagem NRRL Y-7571 em meio orgânico as máximas YFOSs foram de 16,7 e 18,2%, utilizando a enzima livre e imobilizada, respectivamente. Enquanto que em meio aquoso as máximas YFOSs obtidas foram de 15,2 e 16,8%, utilizando a inulinase livre e imobilizada, respectivamente.Abstract: Functional foods, which are beneficial to human beings, have been attracting more and more interest in the last years. Many oligosaccharides, which are also called prebiotics, have been included in some food formulations, making them potentially more healthful. One of the most important effect is the improvement of the good intestinal flora, more significantly the number of the bifidobacteria. The objective of this work was to study the characterization by free and immobilized inulinase; and the optimization of the conversion of sucrose into fructooligosaccharides in organic and aqueous media, from Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 and NRRL Y-7571 using immobilized and free enzyme. Synthesis was carried out in stirred reactors and the synthesis products were identified and measured by ions chromatography. Optimum reaction temperature to ATCC 16045 was 55°C for free and immobilized enzyme for independent of the used percentage of solvent. Better stability temperature was 50°C for free and immobilized with a half-life of about 12 and 38 hours for free and immobilized, respectively. Optimum pH reactions was 4.8 and 4.4 for free and immobilized enzyme, respectively, for independent of the used percentage of solvent. Better stability pH was 4.4, 4.8 and 4.4 for free enzyme with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. To immobilized was 4.8. Kinetic study with the following kinetic constants: Km 0.016, 0.17 and 0.13 M and Vmax 10.6, 34.7 and 23.7 mol/(min.L) for free enzyme with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. And to immobilized were Km 0.0035, 0.006 and 0.025 M and Vmax 39, 60 and 86 mol/(min.L) with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. Optimum reaction temperature to NRRL Y-7571 was 50°C for free independent of the used percentage of solvent and was 55, 60 and 55°C for immobilized enzyme with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. Better stability temperature was 50°C for free and immobilized with a half-life of about 15 and 19 hours for free and immobilized, respectively. Optimum pH reactions was 4.8 for free and immobilized enzyme, for the independent used percentage of solvent. Better stability pH was 4.4, 4.4 and 4.0 for free and 4.0, 4.0 and 4.4 for immobilized enzyme with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. Kinetic study with the following kinetic constants: Km 0.026, 0.038 and 0.08 M and Vmax 11.3, 21.2 and 35.2 mol/(min.L) for free enzyme and to immobilized Km 0.006, 0.002 and 0.01 M and Vmax 22.9, 27 and 33.2 mol/(min.L) with 25, 50 and 70% of solvent, respectively. Factorial design and response surface techniques were used to optimize the synthesis of fructooligosaccharides. Six parameters were studied (pH, temperature, sucrose concentration, enzyme, organic: aqueous solvent ratio and polyethylene glycol [PEG] concentration) on the maximum conversion of sucrose into fructooligosaccharides and productivity. To ATCC 16045 the maximum conversion obtained in organic medium was 13.5 and 18.7%, using free and immobilized enzyme, respectively. The maximum conversion obtained in aqueous medium was 11.9 and 15.3%, using free and immobilized enzyme, respectively. To NRRL Y-7571 the maximum conversion obtained in organic medium was 16.7 and 18.2%, using free and immobilized enzyme, respectively. The maximum conversion obtained in aqueous medium was 15.2 and 16.8%, using free and immobilized enzyme, respectively