Effect of the thermal and enzymatic processing in the attainment of hidrolisados of milk serum with anti-hipertensiva activity.

Resumo: Além das propriedades funcionais tecnológicas e nutricionais, algumas proteínas apresentam atividade biológica, como por exemplo: a influência no metabolismo ósseo apresentada pelas proteínas do soro do leite; atividade antimicrobiana, apresentada pela lactoferrina e a lisozima; atividade imunoestimulante desempenhada pelas imunoglobulinas, entre outras. Essas funções também podem estar associadas aos chamados peptídeos bioativos, presentes em determinadas seqüências da proteína, liberados após a hidrólise enzimática. A industrialização deste tipo de produto está dando seus primeiros passos no sentido do desenvolvimento da produção econômica e de técnicas adequadas que preservem ou concentrem a atividade. O impacto do tratamento térmico para a produção de peptídeos imunomoduladores e caseinofosfopeptídeos tem sido bem estabelecido. No caso dos peptídeos com atividade anti-hipertensiva, ainda há controvérsias sobre a necessidade da manutenção da estrutura nativa antes do tratamento enzimático. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do tratamento térmico e enzimático na obtenção de hidrolisados derivados do isolado protéico de soro de leite com atividade anti-hipertensiva. Como matéria-prima, utilizou-se o isolado protéico de soro de leite (IPSL) Davisco, que foi submetido ao tratamento térmico a 65°C e 95°C, de modo a obter proteínas com dois diferentes graus de desnaturação. Os isolados protéicos nativo e desnaturados foram hidrolisados até 10% de grau de hidrólise (GH), com as enzimas Alcalase, a-quimotripsina e Proteomix. Os hidrolisados obtidos foram caracterizados e analisados quanto à capacidade de inibir a enzima conversora da angiotensina II. Estes hidrolisados foram posteriormente administrados a ratos espontaneamente hipertensos (SHR) para pesquisar a atividade anti-hipertensiva in vivo. A desnaturação parcial das proteínas do soro prévia à hidrólise enzimática, provocada pelo tratamento a 65°C, resultou em hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE, em comparação aos hidrolisados obtidos com a mesma enzima a partir do isolado nativo ou desnaturado a 95°C. Dentre as enzimas empregadas, a que produziu hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foi a ?-quimotripsina, com valores IC50 de 0,40mg/mL para os hidrolisados derivados do IPSL nativo e desnaturado a 95°C e 0,05mg/mL para o hidrolisado desnaturado a 65°C. Por outro lado, o hidrolisado obtido com Alcalase a partir do IPSL desnaturado a 65°C (65A) foi o único a induzir redução significativa da pressão arterial nos ratos SHR até 4hs após a administração por via oral, onde a diferença em relação à pressão arterial basal do grupo foi de -14,94mmHg. Os hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foram administrados aos ratos SHR por via intraperitoneal. O hidrolisado 65A mostrou efeito mais intenso, observado até 6hs após a administração, onde a diferença com a pressão basal foi de -28,1mmHg. O hidrolisado de melhor atividade inibitória da ACE, 65Q, também foi eficiente na redução da pressão arterial dos ratos SHR após administração por via intraperitoneal. A redução da pressão arterial foi significativa até 4hs depois da administração, sendo a diferença de -22,9mmHg em relação à pressão basal. O hidrolisado 65A, que apresentou ação antihipertensiva mais potentes que os demais, reduziu a taxa de filtração glomerular nos ratos SHR de modo dose-dependente e provocou um aumento na reabsorção de sódio, interpretado como um mecanismo auto-regulador para conservação de fluidos e sais. Para verificar a faixa de peso molecular de maior atividade biológica do hidrolisado 65A, este hidrolisado foi ultrafiltrado em membranas de 30kDa e 3kDa, os permeatos foram analisados quanto à capacidade em inibir a ACE, observando-se que a fração de baixo peso molecular (3kDa) apresentou atividade inibitória a ACE menor do que o hidrolisado integral e do que o permeato obtido a partir da membrana de 30kDa (2,37mg/mL, 0,68mg/mL e 0,75mg/mL, respectivamente). Em conclusão, a desnaturação a 65°C do isolado protéico de soro de leite, prévia à hidrólise, promoveu o aumento da atividade inibitória da ACE. Entretanto, a maior parte destes hidrolisados, apesar de manifestar inibição satisfatória sobre a ACE, não foi eficiente em reduzir a pressão arterial dos animais, pois apenas o produto desnaturado a 65°C e hidrolisado pela Alcalase apresentou ação anti-hipertensiva significativa após a administração por via oral, sugerindo que os demais não foram resistentes.Abstract: In addition to the functional and nutritional properties, some proteins present biological activity. For instance, whey proteins influence bone metabolism, lactoferrin and lysozyme present antimicrobial activity, and immunoglobulins have immunomodulating activity. these biological functions may be associated with bioactive peptides released by enzymatic hydrolysis. the industrial manufacture of these products is beginning to develop adequate technologies to preserve or improve the biological activity in an economic manner. the impact of heat treatment on the production of immunomodulators and caseinophosphopeptides has been well established. however, for antihypertensive peptides, little knowledge is available about the necessity of using proteins in their native form before the enzymatic treatment. this thesis was aimed at studying the heat and enzymatic treatments in the production of antihypertensive hydrolysates derived from milk whey protein isolate. the raw material used was the whey protein isolate (wpi) supplied by davisco?. the wpi was heated at 65°c and 95°c to give two different denaturation degrees. the native and denatured wpi were hydrolysed by alcalase, chymotrypsin and proteomix, up to a hydrolysis degree of 10%. the hydrolysates obtained were characterized and analyzed regarding their capacity to inhibit the angiotensin-ii converting enzyme (ace). these hydrolysates were administered to spontaneously hypertensive rats (shr) to study the in vivo antihypertensive activity. The heat treatment at 65°c, before hydrolysis, improved the ace-inhibitory activity of the hydrolysates when compared to the ones obtained by the native isolate or denatured at 95°c wpi. among the enzymes tested, chymotrypsin was the most efficient in the release of ace-inhibitory hydrolysates, with ic50 of 0.40mg/ml to products derived from native and denatured wpi at 95°c, and 0.05mg/ml to the hydrolysate derived from denatured wpi at 65°c. on the other hand, the hydrolysate by alcalase derived from denatured wpi at 65°c (65a) was the only one efficient in decreasing the arterial blood pressure on shr rats up to 4 hours after oral administration; the difference to the basal blood pressure was -14.94mmhg. the best hydrolysate obtained by each enzyme was administrated to the rats by intraperitoneal injection. the activity of the hydrolysate 65a was confirmed by an effective decrease in the animal's arterial blood pressure, observed up to 6 hours after the intraperitoneal administration; the difference to the basal blood pressure was -28.1mmhg. the hydrolysate that presented the best ace-inhibitory activity also decreased significantly the animal's arterial blood pressure via intraperitoneal administration up to 4 hours after the administration. the difference to the basal blood pressure was -22.9mmhg. the hydrolysate 65a with higher antihypertensive activity also induced a decrease in the glomerular filtration in a dose-dependent manner. in addition, it promoted an increase in the sodium reabsorption that can be interpreted as a mechanism for the conservation of sodium and water in response to the decrease in the blood pressure. to evaluate the molecular weight zone of the hydrolysate 65a, it was ultrafiltrated through membranes having cut-off values of 30kda and 3kda. the permeates were analyzed regarding their ace-inhibitory activity. the 3kda permeate contained the lowest percentage of ace-inhibitory activity, when compared to the activity in the unfractionated hydrolysate and the 30kda permeate (2.37mg/ml, 0.68mg/ml and 0.75mg/ml, respectively). in conclusion, the heat denaturation at 65°c in wpi, before enzymatic hydrolysis by alcalase, chymotrypsin and proteomix, improved the ace-inhibitory activity. although most of these hydrolysates present satisfactory ace-inhibitory activity, these were not efficient in reducing the arterial blood pressure of the rats, because only the 65a hydrolysate was efficient when administered orally, suggesting that the others hydrolysates didn't resist at gastric and pancreatic attack