Estudo da biodegradação de hidrocabonetos policiclicos aromaticos por linhagens de microorganismos nativos isolados de sitios ambientais aquaticos contaminados do Estado de São Paulo

Resumo: Com a crescente contaminação do meio ambiente devido às atividades realizadas pelo homem, muitos trabalhos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de apresentar possíveis soluções para a redução da presença de poluentes no meio ambiente. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são considerados poluentes prioritários,sendo agentes mutagênicos e cancerigenos já comprovados.Alguns HPAs de baixo peso molecular são extremamente tóxicos e a maioria dos HPAs com quatro ou mais anéis aromáticos, são considerados agentes genotóxicos e capazes de se acumularem na cadeia alimentar. Os HPAs se originam da combustão incompleta de material orgânico e são eliminados para o meio ambiente através de queimadas, processos industriais,derramamentos de óleo e seus derivados, dentre outras fontes. Devido ao potencial tóxico desses compostos, muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas para defInir os possíveis destinos dos HPAs no meio ambiente. A degradação microbiana, ou biodegradação, é a rota mais utilizada para a eliminação dos HPAs do meio ambiente, sendo os processos de volatilização, sedimentação e fotodecomposição,também responsáveis por sua eliminação. A biorremediação é um processo natural, onde os microrganismos nativos do meio ambiente contaminadosão capazes de utilizar os compostospoluentes como única fonte de carbono, transformando-os através de sua biodegradação,em metabólitos não tóxicos, gás carbônico e água. Algumas vezes, os metabólitos intermediários produzidos são mais tóxicos que os contaminantes originais, sendo necessário o estudo da rota metabólica através da qual os compostos são degradados. o objetivo principal deste trabalho foi o de investigar a ocorrência de microrganismos nativos degradadores de HPAs presentes em sítios ambientais aquáticos do estado de São Paulo, e sua capacidade de biodegradar HPAs presentes nesses locais. Inicialmente, foi feito um levantamento de informações sobre os rios do Estado possivelmente contaminados com HPAs, sendo selecionados 12 rios: Piracicaba, Atibaia, Jaguari, Capivari, Sorocaba, Paraíba do Sul, Tietê, Pinheiros, Tamanduateí, Cubatão, Pedras e Quilombo. A partir desses rios foram retiradas amostras de água para testes microbiológicos e químicos. Para o isolamento e seleção de bactérias degradadoras de HPAs foi utilizada a metodologia de enriquecimento seletivo em Erlenrneyers contendo meio mineral mínimo e diferentes concentrações de HPAs como única fonte de carbono eenergia. Através desta técnica, foi possível o isolamento de 136 linhagens de bactérias, das quais, 25 foram identificadas por testes morfológicos e bioquímicos. Essas 25 linhagens foram testadas em placas de Petri contendo meio mineral sólido e uma camada de spray de HPAs, para verificar a sua resistência e capacidade de crescimento na presença de diferentes HPAs. A partir destes testes, foram selecionadas 4 linhagens que foram utilizadas para os testes de biodegradaçãoem meio líquido, tendo sido testada a capacidade de biodegradação de linhagens de bactérias isoladas e atuando em conjunto, na presença de HPAs puros ou na forma de misturas. A avaliação da capacidade das bactérias em biodegradar os HPAs foi feita através de medidas da biomassa celular contra concentração de HPAs no meio de cultivo (analisada por CLAE). Os metabólitos produzidos durante e ao [mal do período de incubação foram extraídos do meio de cultivo, analisados por CGEM,e tentativamente identificados. As amostras de água dos rios também foram analisadasquanto à presença de HPAs, sendo utilizada para isso a metodologia de extração de HPAs estabelecida pela EPA, seguida da análise dos extratos por CLAE. Os 12 rios foram monitorados por vários meses quanto à variação de temperaturas da água e do ambiente, pH, odor e coloração da água, visando obter informações sobre a sasonalidade dessas características. O sítio aquático do rio Jaguari próximo à REPLAN apresentou as concentrações mais elevadas de HPAs em suas amostras, e a lagoa de tratamento mal da REPLAN foi escolhida para um monitoramento mais detalhado envolvendo medições mensais da concentração de HPAs, número de bactérias heterotróficas totais e degradadoras de HPAs. Foi possível a construção de testes piloto em laboratório, chamados testes de biodegradação em microambiente, onde foram reproduzidas as condições ambientais da lagoa de tratamento, obtendo-se resultados para uma posterior reintrodução das linhagens de bactérias degradadorasde HPAs no meio ambiente.Abstract: During many years human activities are being the mainly cause of the increasing levels of environrnental pollution. Polycyclicaromatic hydrocarbons (PAH) are a class of potentially hazardous chemicals of environrnental and human health concern. Some lowmolecular-weight PAH are acutely toxic. Most higher-molecular-weightPAH containingfour or more rings are genotoxic and there is a potential for their bioaccumulationinto food chains. PAHs are generated during the incomplete combustion of organic material. Usually, PAHs reach the environrnental during burnts, industrial processes, oil and its derivatives spils and other several processes. Given the knowing hazards associated with these chemicals, there is much interest in their environrnentalfate. Microbial degradation is the major route through which PAHs are removed from contaminated environrnental, although other mechanisms such as volatilization, leaching and photodegradation may also be effective. Bioremediationis a natural process in which indigenousmicroorganisms from the contaminated site are capable of growing using toxical compounds as single carbon source, transforming them to less toxic compounds,carbon dioxide and water. Sometimes, intermediary metabolites are more dangerous than original contaminants, than it is necessary to search which are the metabolicspathways through which bacteria degrade this compounds. The mais purpose of this research was to investigate the indigenousmicroorganisms occurence in acquatic sites from São Paulo state and their capability on biodegradate PAHs present in this sites. lnnitial studies involved the search for information about rivers from São Paulo state possibly contaminated with PAHs. Twelve rivers were found: Piracicaba, Atibaia, Jaguari, Capivari, Sorocaba, Paraíba do Sul, Tietê , Pinheiros, Tamanduateí, Cubatão, Pedras and Quilombo. Water samples from the rivers were analysed through microbiological and chemical tests. Screening of PAHs degraders bacteria was done using a selective enrichment methodology, in Erlenrneyerswith mineral minima medium and different PAHs concentratiosas sole carbon and energy source. It was possible to isolate 136 bacterial strains, from which, 25 were morphologicaly and biochemicaly tested. These 25 strains were tested in Petri dishes containing solid mineral minirna medium and a sprayed layer of PAH in its surface. This test was done in order to verify strains resistence and growth capability in the presence of PAHs. Four strains were selected and submited to liquid medium biodegradation tests. Strains were inoculated purely or in a mixture of strains in the presence of differents PAHs mixtures. Biodegradation os PAHs was tested using cellular biomass x PAHs concentration in the growth medium (using HPLC analysis). Metabolic production during and after incubationperiod was measured using GC-MS analysis. PAHs concentration in water samples from rivers were determinated using EPA extraction procedures and HPLC analysis of extracts. The 12 rivers studied were monitored monthly during one year. Water temperature, pH, odour and colour alterations during different season were measured. The Jaguari river acquatic site, close to REPLAN, an oil refmery, showed the highest PAHs concentrations and waste treatment site from REPLAN was choosed to be closer monitored. PAH concentration, total heterothrophic and PAHs degraders bacterial populations were measured monthly. It was possible to conducte pilot-scale tests in laboratory -microcosmos bioremediation tests - where waste treatment site conditions were reproduced in order to obtain information for further PAHs degraders bacterial strains reintroduction in the site