Produção de inulinase por Kluyveromyces marxianus e purificação da enzima por cromatografia de troca ionica em coluna de leito expandido

Resumo: Frutose é o açúcar natural mais doce, sendo uma alternativa segura para substituir a sacarose. A lnulinase tem um importante papel na produção de uutose através da hidrólise enzimática da inulina, que pode ser realizada em uma única etapa e render até 95% de conversão. Este trabalho teve por objetivos otimizar as condições de produção da enzima inulinaseproduzida por Kluyveromyces marxianus ATCC 16045, otimizar as condições de reação sobre a sacarose e a inulina e recuperar a enzima em coluna de leito expandido utilizando a resina de troca iônica Strearnline SP. Técnicas de planejamento experimental e análise de superficie de resposta foram utilizadas para otimizar o meio de cultura para produção da enzima e as condições de determinação da atividade enzimática. Na produção da enzima foram estudadas as variáveis concentração de sacarose, extrato de levedura, peptona, K2HP04 e pH. Para tanto utilizou-se um planejamentofatorial uacionário (25-1)para determinar as variáveis mais importantes, sendo selecionadas três para serem utilizadas em um planejamento fatorial completo. A enzima obtida foi utilizada nos ensaios de determinação enzimática para verificar os efeitos da concentração de substrato (sacaroseou inulina), pH e temperatura na atividade de inulinase. Usando-se sacarose como substrato, verificou-se que a temperatura e o pH são as variáveis mais importantes e no caso da inulina somente a temperatura, dentro das faixas estudadas. A atividade enzimática passou de 9 para Ii OU/rnL após o estudo de otimização da produção da enzima. O caldo bruto clarificado foi utilizado para determinar a isoterma e cinética de adsorção da inulinase extracelular em resina de troca iônica Strearnline SP. Através dos dados experimentais de adsorção e mediante modelagem matemática, obteve-se os parâmetros cinéticos intrínsecos e os de transporte de massa. Os valores encontrados foram: kl=6,25.1O-3rnLlU.mÍn. e k2=2,09.1O-3mÍn.-1independentemente da concentração de meio na solução. Os parâmetros coeficiente de transferência de massa (Ks) e difusividade efetiva (Def) foram 5,03.10-2, 5,03.10-4, 5,03.10-4cm/s e 1,105.10-6, 6,58.10-7 , 3,25.10-7 cm2/s para 45%, 60% e 100% de caldo bruto na solução estudadarespectivamente. Os ensaios no leito expandido com o meio não clarificado permitiram determinar o expoente de Richardson -Zaki (5,3) e a velocidade terminal (17,6 cm/min.). Através dos ensaios de adsorção obteve-se as curvas de ruptura e determinou-se o grau de expansão mais adequado para a purificação da enzima (expansão de 2 vezes). Através dos testes de purificação da inulinase diretamente do caldo bruto, obteve-se uma recuperação de 74% e um fator de purificação de 10,4 vezes para a eluição do tipo degrauAbstract: Fructose is the sweetest sugar, being a safe alternative for sucrose. Inulinase may play an important role in fiuctose production, by enzymatic hydrolysis of inulin. The reaction occurs in a single step and it is possible to obtain up to 95% of conversion. In this work the optimization of the conditions for both inulinase production by Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 and inulinase reaction on sucrose and inulin are proposed,as well as, the enzyme purification using an expanded bed with the ion exchanger Strearnline SP is studied. Factorial design and surface response analysis were used to optimize the culture conditions for inulinase production and the enzymatic reaction parameters. In the enzyme production thefollowing variables were studied: sucrose, yeast extract, peptone and K2HPO4concentration and pH. The technique of factorial fiactional design (25-1)was used, resulting in the selection of three variables utilization in a complete factorial designo The inulinase produced in fermentation forKluyveromyces marxianus was used to verify the effects of substrate concentration, pH and temperature on enzymatic reaction. Using sucrose as substrate it was verified that temperature and pH were the most important variables. However, when inulin was used as substrate only the temperature was selected. The enzymatic activity increased fiom 9 U/rnL to 110 U/rnL after production optimizationby Surface Response Analysis. In terms of enzyme purification, the filtrate of crude broth was used for the determination of the adsorption isotherm and the adsorption kinects of inulinase on the ion exchanger Strearnline SP. The kinetics parameters were: kl=6.25.1O-3rnL/U.min. and k2=2.09.1O-3min.-1. For 45%,60% and100% of crude broth of the solution, the film coefficient (Ks) of 5.03.10-2, 5.03.10-4, 5.03.10-4 cm/s and the effective diffusion coefficient (Def) of 1.105.10-6,6.58.10-7 , 3.25.10-7 cm% were determined using the experimental results and mathematical modeling. The trials on expanded bed with crude broth were carried out to determine the Richarson - Zaki exponent (5.3) and terminal settling velocity (17.6 cm/min.). The studies of inulinase adsorption performance were used to obtain the breakthrough curves and established the best degree of bed expansion for enzyme recuperation. The inulinase was purified directly fiom an unclarifiedbroth in 74% with a purification factor of 10.4 for elution ste