Sintese de oligossacarideos a partir da sacarose por inulinase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus

Resumo: Oligossacarídeos são considerados como novos ingredientes funcionais dos alimentos, sendo denominados como prebióticos, devido as suas características fisiológicas e tecnológicas. Podem ser produzidos a partir da sacarose, matéria prima abundante no Brasil, pela ação de enzimas. A inulinase tem como principal característica a atividade hidrolítica frente à inulina, mostrando em certas condições, atividade de transfrutosilação, como demonstrado em trabalhos recentes realizados com a inulinase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, caracterizada pela formação de frutooligossacarídeos (kestose, nistose e 1-frutosilnistose). Baseando-se nestes estudos, este trabalho teve como objetivo principal estudar a atividade de transfrutosilação desta enzima.Inicialmente produziu-se da enzima por fermentação em frascos agitados, obtendo uma máxima atividade de 301 UI/mL no pH 3,4 e temperatura 23°C. Em seguida, estudou-se a otimização do processo de purificação utilizando resinas trocadoras de íons, sendo a resina aniônica Q-Sepharose FF a que apresentou melhores resultados, tanto em relação ao fator de purificação (23 vezes em relação ao caldo bruto), quanto ao de recuperação (70%).A partir da enzima purificada determinou-se o pH 4,4 como sendo o ótimo de reação para a enzima na forma livre e 4,8 para a enzima imobilizada em alginato de cálcio. Quanto ao pH de estabilidade obteve-se para a enzima livre o melhor resultado a pH 4,8, correspondendo à uma meia vida de aproximadamente 10 dias, a 50°C, enquanto que para a enzima imobilizada o melhor pH foi 4,6, com uma meia vida de aproximadamente 6 dias, a 45°C. A temperatura ótima de reação foi de 60°C e 57,5°C para a enzima livre e imobilizada, respectivamente.No estudo cinético, observou-se que a equação de Michaelis-Menten com termo de inibição pelo substrato ajustou-se bem aos dados experimentais e obtendo-se os seguintes valores para as constantes cinéticas: Km= 0,0389 e 0,1070 M, Vmax=86,96.10-9 e 36,90.10-9 mol/min.L, Ki=0,5857 e 1,3548 M: para as enzimas livre e imobilizada respectivamente. Estudando os efeitos inibitórios da concentração de glicose e frutose, verificou-se que, em baixas concentrações de sacarose (5 a 20 g/L), o aumento da concentração de frutose e glicose diminui a atividade da enzima, denotando inibição pelos produtos. Por outro lado, em altas concentrações de sacarose (150 a 500 g/L), onde se verifica uma forte inibição pelo substrato, houve um aumento na atividade enzimática na presença de glicose e frutose a 75 g/L.Para o estudo da síntese de frutooligossacarídeos utilizou-se a técnica de planejamento experimental, obtendo-se a melhor condição a pH 6,0, temperatura de 50°C, 450 g/L de sacarose e 4 UI/mL de atividade enzimática final no reator, obtendo-se uma conversão de 12,65 %. A máxima produção de oligossacarídeos foi de 82 g/L, obtida com a adição de 200 g/L de glicose como aceptor e 500 g/L de sacarose. Também foi feito um estudo comparativo de síntese, com a enzima imobilizada em reator de leito fixo e de mistura e na forma livre. Em todos os casos foram obtidos 50 g/L de frutooligossacarídeos.Abstract: Oligosaccharides have great potential as new functional ingredients for foods. They have been denominated as prebiotic, due to their physiological and technological characteristics. They can be produced from sucrose, an abundant raw material in Brazil, by the enzyme inulinase. This enzyme has as its main characteristic the hydrolytic activity of inulin. However, it also shows, in certain conditions, an activity of transfructosilation, as demonstrated in recent studies carried out with inulinase of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, characterized by the formation of fructooligosaccharides (kestose, nystose and 1-frutosil nystose). Based in these studies, this work has as main goal to study the activity of transfructosilation of this enzyme.Initially, the optimization of the production of the enzyme by fermentation with Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC 16045 was carried out, led to a maximum activity of 301 UI/mL at pH 3.4 and 20°C. Subsequently, the optimization of the purification process was studied using ion exchange resins. Q-Sepharose FF anionic resin was shown to be the most appropriate resin, leading to a 23 fold purification factor, and 70% recovery.Optimum pH reactions were shown to be 4.4 and 4.8 for free and calcium alginate immobilized enzyme. However, better enzyme stability was observed at pH 4.8 for free enzyme, corresponding to a half-life of about 10 days, at 50°C, whereas it was pH 4.6, with a half-life of about 6 days, at 45°C. The optimum reaction temperature was 60&C and 57.5°C for immobilized the free enzyme, respectively.Michaelis-Menten equation with substrate inhibition fitted well the experimental data with the following kinetic constants: Km= 0.0389 and 0.1070 M, Vmax= 86.956.10-9 and 36.90.10-9 mol/min.L, Kf= 0.5857 and 1.3548 M, for enzymes free and immobilized respectively. The inhibition effects of the glucose and fructose were studied and it has been shown that, in low concentrations of sucrose (5 to 20 g/L), the increase in the fructose and glucose concentrations led to a decrease in the enzymatic activity. On the other hand, at high concentrations of sucrose (50 up to 500 g/L), where a strong inhibition by the substrate is observed, an increase in the enzyme activity was observed when fructose and glucose concentrations were 75 g/L.The synthesis of fructooligosaccharides was optimized using the technique of experimental design, led to the following optimal conditions: pH 6.0, temperature of 50°C, sucrose 450 g/L and 4 UI/mL enzymatic activity in the reactor, giving a conversion of about 13 %. The maximum production of oligosaccharides (82 g/L) was reached when 200 g/L of glucose was used as acceptor, with 500 of g/L of sucrose. In a comparative study with immobilized enzyme in fixed bed and mixture reactors the production of about 50 g/L of fructooligosaccharides was obtained in all case