Production, purification and chemical characterization of biosurfactant produced by Bacillus subtilis from raw glycerol

Resumo: Os biossurfactantes são compostos amplamente estudados em todo o mundo. Suas características o tornam muito atrativo em relação aos surfactantes sintéticos. Dentre essas características podemos citar, a baixa toxicidade, boa compatibilidade com a pele e olhos, biodegradabilidade e produção a partir de substratos renováveis. No entanto, o custo de produção dos biossurfactantes ainda inviabiliza sua produção em escala industrial. Tradicionalmente, os hidrocarbonetos têm sido os substratos escolhidos para a produção de biossurfactantes e bioemulsicadores. É assumido que a produção de biossurfactantes é induzida para tornar o substrato hidrofóbico acessível a célula. Contudo, substratos solúveis em água também podem ser utilizados para a produção dos surfactantes biológicos. Esses últimos são mais baratos do que os hidrocarbonetos e preferidos em processos fermentativos, devido ao fato de que as fermentações monofásicas são mais simples do que as fermentações bifásicas. Além disso, o uso de hidrocarbonetos são inaceitáveis para a produção de biossurfactantes destinados a aplicações em alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos. Uma grande variedade de matérias-primas estão atualmente disponíveis como substrato orgânico para fermentações industriais, dentre as quais podemos destacar os resíduos agroindustriais. Essas matérias-primas possuem vantagens de serem encontradas em excesso e produzidas em regiões de clima tropical ou temperado. Atualmente, com o aumento da demanda de produção de biodiesel, o glicerol tem ganhado atenção no cenário de bioprocessos, demonstrando ser uma matéria-prima de grande disponibilidade para produção de biomoléculas de interesse industrial. Segundo a Agência Nacional de Petróleo (ANP-Brasil), o Brasil é ranqueado como o maior produtor e consumidor de biodiesel do mundo: 1,2 bilhões de litros/ano em 2008, gerando de 120.000 toneladas de glicerina residual nesse processo. Logo, o presente trabalho teve como objetivo selecionar um substrato orgânico de baixo custo, de forma a tornar viável a produção e comercialização dos biossurfactantes em larga escala. Dentre as 19 linhagens microbianas avaliadas, o microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 foi selecionado para a produção de biossurfactantes, utilizando glicerina residual bruta como substrato orgânico. A temperatura de 32oC e concentração de glicerina de 5% v/v foram designadas como condições ótimas para a produção de biossurfactantes, através do planejamento experimental. A produção dos biossurfactantes foi realizada em fermentador um litro nas rotações de 150, 250 e 350 rev.min -1. A fermentação conduzida à 250 rev.min-1 apresentou melhor desempenho na formação de espuma e produção de biossurfactante. Em seguida, essa condição foi reproduzida em fermentador de 10 litros, que apresentou rendimento de 0,69 g.L-1. Após a execu-ção dos processos fermentativos, os biossurfactantes foram recuperados por precipitação ácida, puri_cados em coluna de adsorção e caracterizados utilizando Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier (IV-FT), Espectrometria de Ressonância Magnética (1H e 13C RMN) e Espectrometria de Massa (ESI-MS/MS). O biossurfactante foi caracterizado como uma isoforma do lipopeptídio surfactina, contendo 14 átomos de carbono na cadeia lipídica e sete aminoácidos do anel peptíco. A espectrometria de massa foi capaz de elucidar a composição e sequência de aminoácidos do peptídio cíclico GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7) e os espectros de 1H e 13C - RMN foram de extrema importância para comprovar a esteri_cação do aminoácido ácido glutâmico. O microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 também foi caracterizado como co-produtor de fengicina. A espectrometria de massa apresentou ser uma técnica sensível e rápida para a caracterização dos homólogos A e B de fengicina. A surfactina C14/Leu7 foi avaliada com relação a toxicidade ambiental sobDaphnia similis, apresentando EC50 em 1500 mg.L-1. A surfactina apresentou atividade antiviral contra o vírus envelopado Herpervirus bovino (BoHV-1), inibindo 100% da infectividade do vírus na concentração de 0,25 _M, porém, não apresentou atividade antimicrobiana para os microrganismos avaliados até a concentração de 1mg.mL-1. A surfactina também foi avaliada com relação a citotoxicidade sob _broblastos c3T3 de camundongos, e o valor de EC50 não foi determinado na faixa de concentração estudada, indicando níveis de toxicidade para esse tipo de célula. No âmbito na nanotecnologia, o extrato bruto contendo os biossurfactantes mostrou-se uma ferramenta útil na dispersão de nanotubos de carbono, em água de cultivo de Daphnia, tornando possível o estudo de ecotoxicologia desses nanomateriaisAbstract: In recent years biosurfactants have attracted considerable attention because they o_er several advantages in comparison with synthetic surfactants: low toxicity, greater biodegradability, better environmental compatibility, greater foaming, speci_c activity at extreme temperatures, pH and salinity, and the possibility of being produced from renewable sources and industrial wastes However, biosurfactants have not yet been employed extensively in industry because of their relatively high production and recovery costs. The cost can be reduced by strain improvement, optimizing medium composition by statistical methods or by using alternative inexpensive substrates. Traditionally, hydrocarbons have been the substrates of choice to produce biosurfactants and bioemulsi_ers. It is assumed that surfactant production is induced to render hydrophobic substrates accessible to the cell, but water-soluble substrates such as molasses, cassava waste-water and potato substrates have also been used for biosurfactant production. The latter are cheaper than hydrocarbons and are the preferred substrates, because single-phase fermentation is simpler than biphasic fermentation and in addition the hydrocarbon substrates are unacceptable for many applications, such as in foods, cosmetics and pharmaceutical products. One alternative substrate aimed at decreasing costs in the production of biosurfactants could be the waste glycerol obtained from the biodiesel industry. Brazil is ranked amongst the greatest producers and consumers of biodiesel in the world: 1.2 billion liters /year in 2008, according to the National Petroleum Agency-Brazil (ANP) generating 120,000 tons of waste glycerol in this process. The data described above may support the idea of applying the raw glycerol in the production of biosurfactant on a large-scale. This present study aimed to select an low cost organic substrate, in order to become viable the biosurfactant production on a large scale. Among the 19 microbial strains evaluated, the microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was selected for the biosurfactant production using raw glycerol as organic substrate. The temperature of 32oC and glycerol concentration of 5% v/v were designated as optimal conditions for the production of biosurfactants, by response surface methodology. The production of biosurfactants was carried out by one liter fermentor at 150, 250 and 350 rev.min-1. The 250 rev.min-1 fermentation was the best performance in foaming and biosurfactant production. Then, this condition was reproduced in 10 liter fermentor, with yield of 0.69 g.L-1. After the fermentation processes, the biosurfactants were recovered by acid precipitation, puri_ed by adsorption column and characterized using Infrared Spectroscopy Fourier Transform (FT-IR), Magnetic Resonance Spectroscopy ( 1H and 13C NMR) and Mass Spectrometry (ESI-MS/MS). The biosurfactant was characterized as a surfactin isoform, containing14 carbon atoms in the lipid chain and 7 aminoacids in the peptide portion. The mass spectrometer was able to elucidate the composition and aminoacids sequence in the cyclic peptide GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7). The microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was characterized as a fengycin co-producer. The mass spectrometry have been a sensitive and rapid technique for fengycin homologues characterization. The C14/Leu7 surfactin presented EC50 value of the 1500 mg.L-1 against Daphnia similis in ecotoxicological studies. The surfactin showed antiviral activity against enveloped bovine herpesvirus (BoHV-1), inhibiting 100 % of the infectivity at concentration of 0.25 _M, however, it didn't show antimicrobial activity for microorganisms evaluated until concentration of 1mg.mL-1. The surfactin cytotoxicity in mice _broblasts c3T3 was evaluated as well, and the EC50 value was not determined in the studied concentration range, indicating low levels of toxicity for this cell type. Concerning to applications in nanotechnology, the biosurfactants proved to be a useful tool in the dispersion of carbon nanotubes in standard water cultivation of Daphnia, enabling future studies about the environmental toxicology of these nanomaterial