Ocurrence and assessment of enterotoxigenic potencia of Staphylococcus isolated from dairy products

Resumo: Staphylococcus são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais suas principais fontes. A contaminação cruzada após a pasteurização do leite, especialmente por manipulação inadequada, é apontada como a mais importante forma de contaminação dos derivados do leite por estes patógenos, que são importantes em alimentos devido à sua habilidade de produzir uma grande quantidade de proteínas extracelulares (enterotoxinas) que, se pré-formadas no alimento e ingeridas, causam a intoxicação estafilocócica. Apesar da legislação brasileira (RDC 12/2001, Anvisa) preconizar apenas a contagem de Staphylococcus coagulase positiva, relacionando a produção da coagulase com o risco de produção de enterotoxinas, já foi comprovado que espécies coagulase negativas também são capazes de produzir enterotoxinas nos alimentos. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: i) quantificar e analisar a presença de Staphylococcus coagulase positiva e negativa em 104 amostras de derivados lácteos, sendo 24 de sorvete artesanal, 20 de creme de leite pasteurizado, 20 de patê à base de queijo, 20 de queijo Minas frescal e 20 de queijo Minas meia cura; ii) identificar fenotipicamente as espécies isoladas; iii) avaliar a produção de enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE) in vitro pelo sistema VIDAS e relacionar os resultados obtidos com a presença de possíveis genes codificadores destas enterotoxinas, pela aplicação da técnica de PCR. Os valores médios de contagens preliminares nos diferentes grupos de alimentos analisados foram: 5 x 103 UFC/g em sorvete, 2,9 x 105 UFC/g em creme de leite, 6,2 x 103 UFC/g em patê, 6,6 x 105 UFC/g em queijo Minas frescal e 6,4 x 105 UFC/g em queijo Minas meia cura. Do total de isolados, 83,6% (148/177) foram classificados como sendo do gênero Staphylococcus e 16,4% (29/177) como Micrococcus. Staphylococcus foram isolados de 43,3% (45/104) das amostras, sendo detectados em 25 amostras de queijos, em 16 sorvetes, em 3 patês e em apenas 1 amostra de creme de leite. Entre os isolados de Staphylococcus, 74,3% (110/148) eram coagulase negativa e 25,7% (38/148) eram coagulase positiva recuperados apenas nas amostras de queijos. Dos 111 isolados selecionados (27 coagulase positiva e 84 coagulase negativa), foram identificadas 13 espécies através do sistema API-Staph (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas clássicas, foi utilizado o kit (bioMérieux-SA). Dos?imunoenzimático ViDAS SET ¿Staph enterotoxin¿ 111 isolados, apenas um (0,9%) produziu enterotoxina, sendo este identificado como S. aureus, coagulase positiva, isolado a partir de queijo Minas meia cura, cuja contagem foi de 1,9 x 106 UFC/g. Ao contrário do esperado, não foram detectados genes codificadores das 5 enterotoxinas em nunhum dos isolados analisados. Discrepâncias entre resultados de testes fenotípicos e genotípicos para detecção de enterotoxinas são comuns, sendo necessária a realização de outros testes imunológicos e moleculares para confirmação destes resultados. Possíveis justificativas seriam a existência de variações nas sequências dos genes do isolado ou a presença de uma toxina que possui reação imunológica cruzada com as enterotoxinas clássicas. Neste estudo, apesar da quase totalidade dos isolados não terem produzido enterotoxinas clássicas, havia um número bem elevado de Staphylococcus em diversos produtos analisados, não excluindo um possível risco de produção das demais enterotoxinas já descritas e demonstrando a falta de cuidados higiênico-sanitários e de boas práticas durante a produção e comercialização destes alimentosAbstract: Staphylococcus are microorganisms widespread in nature and humans and animals are their main sources. Cross-contamination after milk pasteurization, caused especially by improper handling, is considered the most recurrent source of dairy products contamination by these pathogens. Staphylococus deserves our close attention due their ability to produce a large amount of extracellular proteins (enterotoxins), that if preformed in food and ingested, cause staphylococcal food poisoning. Although the Brazilian legislation (RDC 12/2001, Anvisa) only recommends coagulase-positive staphylococci count monitoring (relating coagulase production to the risk of enterotoxins production), previous researches showed that coagulase-negative species are also capable of producing enterotoxins in foods. Thus, this research aimed: i) to quantify and analyze the presence of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci from 104 dairy products samples, being: 24 homemade ice cream, 20 pasteurized dairy cream, 20 cheese pate, 20 Minas fresh cheese, and 20 Minas half cured cheese; ii) to identify phenotypically the species; iii) to evaluate the production of classic enterotoxins (SEA, SEB, Sec1, 2.3, SED and SEE) in vitro by using VIDAS system and correlate the results to the presence of possible coding genes of these enterotoxins, applying the PCR technique. The average staphylococcal preliminary count values in different food groups analyzed were: 5 x 103 CFU/g in ice cream, 2,9 x 105 CFU/g in dairy cream, 6,2 x 103 CFU/g in pate, 6,6 x 105 CFU/g in Minas fresh cheese and 6,4 x 105 CFU/g in Minas half cured cheese. From isolated strains, 83,6% (148/177) were classified as genus Staphylococcus and 16,4% (29/177) as Micrococcus. Staphylococcus were isolated from 43,3% (45/104) of samples, being found in 25 cheese samples, in 16 ice creams, in 3 pates and in just one dairy cream sample. Among staphylococcal strains, 74,3% (110/148) were coagulase-negative Staphylococcus and 25,7% (38/148) were coagulase-positive Staphylococcus, being these recovered only from cheeses samples. On 111 selected isolates (27 coagulase-positive and 84 coagulase-negative), were identified 13 staphylococcal species by using API-Staph system (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. For classical staphylococcal enterotoxins detection was used VIDAS SET Staph- Enterotoxin immunoassay kit (bioMérieux-SA). From 111 isolates, just one (0,9%) produced enterotoxin, which was identified as S. aureus, coagulasepositive, isolated from Minas half cured cheese, whose count was 1,9 x 106 CFU/g. Contrary to expectations, no coding genes were present in isolates analyzed. Discrepancies between phenotypic and genotypic results of enterotoxin detection tests are common, requiring the application of other immunological and molecular tests for the confirmation of the results. Possible explanations would be that there are genes sequences variations or another enterotoxin that has immunological cross-reaction with classic enterotoxins. For this research, although the higher number of the isolates did not produce classical enterotoxins, the analyzed samples showed high staphylococcal concentration, that do not exclude a newly described enterotoxins risk production. It also demonstrates the lack of hygiene, health care and good practices during the production and commercialization of dairy product