Biological evaluation of fruits from the Brazilian Cerrado : Guapeva, Gabiroba and Murici

Resumo: A ingestão de muitas frutas convencionais, exóticas e nativas está associada com a redução do risco de doenças crônicas não transmissíveis e até mesmo o câncer. Neste contexto, o presente trabalho tem como proposta estudar atividades biológicas bem como identificar e quantificar os compostos fenólicos das frutas do Cerrado brasileiro, Guapeva (Pouteria cf. guardneriana Radlk.), Murici (Byrsonima verbascifolia Rich.) e Gabiroba (Compomanesia cambessedeana O. Berg.). Além dos compostos fenólicos, foram investigadas as atividades antioxidante, antiinflamatória, antimutagência, antigenotóxica, antiproliferativa e citotóxica. Os compostos fenólicos foram extraídos com etanol 95% e com água. Os fenólicos lipofílicos foram extraídos, a partir da fruta, com hexano. A quantificação dos compostos fenólicos foi realizada e os extratos etanólicos apresentaram melhores resultados quando comparados com os aquosos. O extrato etanólico da Gabiroba concentração de fenólicos de 4610,46 mg Ácido Gálico/100g fruta fresca, sendo superior a todos os outros extratos. Também foi realizada a quantificação dos flavonóides totais, mas apenas para os extratos etanólicos, e a semente da Guapeva apresentou o resultado mais relevante, no valor de 2915,62 mg Catequina/100g fruta fresca. Os extratos do Cerrados foram avaliados quanto a capacidade antioxidante in vitro através dos métodos 2,2- Diphenyl ¿ 1- picrylhydrazil (DPPH), Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC), Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) e Peroxyl Radical cavenging Capacity (PSC). Os resultados do teste DPPH foram expostos de duas formas diferentes, como equivalentes de Trolox onde o extrato etanólico da casca da Guapeva destacou-se por apresentar maior potencial antioxidante nos 3 tempos analisados (30, 60 e 90 minutos) e também como IC50, onde o extrato etanólico da Gabiroba apresentou melhor resultado no valor de 11,10 µg/mL de fruta fresca. Para o teste TEAC os extratos etanólicos da casca da Guapeva e a Gabiroba apresentaram maior potencial antioxidante, com resultados de 1543,53 e 1014,25 µM Trolox Equivalentes/100g fruta fresca, respectivamente. Já para os ensaios ORAC e PSC o extrato etanólico da Gabiroba apresentou maior atividade, com resultados de 43780,00 µM TE/100g de fruta e 2342,52 µM Vitamina C/100 g fruta fresca, respectivamente. A identificação e quantificação dos compostos fenólicos presentes nos extratos foram realizadas por Cromatografia líquida de alta eficiência. Foram identificados Ácido ferrúlico, Resveratrol, Etil galato, Catequina, Propil galato e Epicatequina. Ratos foram tratados com os extratos de frutas e o plasma foi coletado 30, 60 e 90 minutos após a gavagem para análise pelos métodos ORAC, TEAC e fenóis totais. O extrato de casca da Guapeva apresentou maior concentração de fenóis totais após trinta minutos da ingestão e o Murici após 1 hora. Através da análise TEAC, todos os extratos apresentaram maior atividade antioxidante no tempo de 30 minutos quando comparado com os demais tempos. No ensaio ORAC todos os extratos apresentaram maior potencial nos períodos de 30 e 60 minutos. A identificação dos compostos fenólicos no plasma foi determinada por Espectrometria de Massas, sendo que apenas a Catequina foi identificada no grupo que foi tratado com Gabiroba. O potencial antimutagênico/mutagênico foi determinado pelo teste in vivo de Micronúcleos. Todos os extratos mostraram-se antimutagênicos e não mutagênicos. O extrato com maior efeito protetor contra a droga Ciclofosfamida foi o Murici 400 mg extrato/kg P.C. com efeito redutor de 97,71%. A avaliação do efeito antiinflamatório foi realizada pelo teste de Edema de pata, induzido por Carragenina e todos os extratos apresentaram ação antiinflamatória. Também verificou-se que a partir da segunda hora após a injeção da Carragenina, o efeito antiinflamatório apresentado por todos extratos, aumentou. O efeito antigenotóxico foi avaliado pelo ensaio Cometa in vivo. Todos os extratos avaliados não danificaram o DNA e os que apresentaram maior proteção contra dano/lesão no DNA foram a polpa, casca e semente da Guapeva na concentração de 200 mg extrato/kg P.C. e o Murici na concentração de 400 mg extrato/kg P.C. Oito linhagens tumorais humanas foram utilizadas na determinação do potencial antiproliferativo, apenas a Guapeva casca, polpa e o Murici apresentaram início de efeito citostático. A atividade citotóxica e antiproliferativa foi avaliada em hepatocarcinoma humano (HepG2), a semente da fruta Guapeva apresentou citotoxicidade, e a casca e polpa da fruta Guapeva, assim como a Gabiroba se destacaram no potencial antiproliferativo com valores de 11,75; 12,57 e 8,35 mg/mL. O potencial antioxidante celular foi avaliado e a casca da fruta Guapeva apresentou maior atividade, no valor de 99,91 µmol Quercetina/100g fruta de fresca. De acordo com nosso conhecimento, este foi o estudo mais aprofundado sobre as propriedades biológicas das frutas do Cerrado, e que possivelmente possibilitará a utilização destes como alimento funcionalAbstract: There is an association between the conventional intake of many fruits (exotic native species) with reduced risk of chronic diseases and even cancer. In this context, this work aims to study the biological activities, identify and quantify the phenolic compounds of Cerrado´s fruits, the Guapeva (Pouteria cf. Guardneriana Radlk), Murici (verbascifolia Byrsonima Rich) and Gabiroba (Compomanesia cambessedeana O. Berg). In addition, we investigated the antioxidant, anti-inflammatory, antimutagenic, antigenotoxic, antiproliferative and cytotoxic properties of these fruits. Phenolic compounds were extracted with 95% ethanol and water. The lipophilic phenolics were extracted from the fruit with hexane. The quantification of phenolic compounds was performed and the ethanol extracts presented better results when compared with aqueous extracts. The Gabiroba extract showed the total phenolic concentration of 4610.46 mg Gallic acid/100g fresh fruit, higher than all other analyzed extracts. Total flavonoids were also quantified, but only the ethanol extracts were used. The seed of the Guapeva presented the most relevant results, amounting to 2915.62 mg Catechin /100g fresh fruit. The Cerrado´s extracts were evaluated for antioxidant capacity in vitro using the methods 2,2- Diphenyl ¿ 1- picrylhydrazil (DPPH), Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC), Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) e Peroxyl Radical cavenging Capacity (PSC). The DPPH test results were presented in two different ways, one as Trolox equivalents, in which the ethanol extract of the peel of the Guapeva resulted in the highest antioxidant potential for the three analyzed times (30, 60 and 90 minutes) and the other way as EC50, in which it was observed that the ethanol extract of Gabiroba had the best result with a value of 11.10 µg/mL of fresh fruit. From the TEAC test, ethanol extracts of the peel of Guapeva and Gabiroba showed higher antioxidant potential, the results were 1543.53 and 1014.25 uM Trolox Equivalents/100g of fresh fruit, respectively. For the ORAC and PSC tests, the ethanol extract of the Gabiroba presented the highest activity, with results of 43,780.00 µM TE/100g of fresh fruit and 2342.52 µM Vitamin C/100g of fresh fruit, respectively. The identification and quantification of phenolic compounds in the extracts were performed by high performance liquid chromatography. The following standards were identified: Ferrulic acid, resveratrol, ethyl gallate, catechin, Propyl gallate, and epicatechin. Rats were treated with the extract of fruits and plasma was collected 30, 60 and 90 min after gavage for analysis by the methods ORAC, TEAC and Total phenolics. The peel of the Guapeva extract showed the highest concentration of phenolics thirty minutes after treatment and the Murici presented the highest concentration after 1 hour of ingestion. For the TEAC test, all extracts showed higher antioxidant activity at 30 minutes compared to the other analyzed periods. For the ORAC assay, all the extracts had the greatest potential in periods between 30 and 60 minutes. The identification of phenolic compounds in plasma was determined by mass spectrometry, and only the Catechin was identified in the group of animals that received the Gabiroba extract. The antimutagenic / mutagenic test was determined by in vivo micronucleus test. None of the extracts show mutagenic properties. The extract with the greatest protective effect against Cyclophosphamide drug was the Murici at 400 mg extract / kg body weight, presenting reduction effect of 97.71%. The evaluation of anti-inflammatory effect was accomplished by testing the paw edema induced by the Carrageenan drug and it was observed that all extracts showed anti-inflammatory properties. It was also found that from the second hour after injection of Carrageenan, all extracts presented an increase of anti-inflammatory effects. The antigenotoxic effect was evaluated by Comet assay in vivo. All the extracts evaluated did not induce DNA damage, the extracts that provided greater protection against DNA damage were the pulp, peel and seed of Guapeva at 200 mg extract/kg body weight and Murici at 400 mg extract/kg body. Eight human tumor cell lines were used to determine the potential antiproliferative effects of the fruits, however just the peel, pulp of Guapeva and Murici showed cytostatic effects. The antiproliferative and cytotoxicity activities were evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2). The seeds of Guapeva presented cytotoxicity, and the peel and pulp of Guapeva, and Gabiroba showed the highest antiproliferative potential with values of 11.75, 12.57 and 8.35 mg/mL, respectively. The cellular antioxidant potential was tested and the peel of the Guapeva showed the highest activity, amounting to 99.91 µmol Quercetin/100g fresh fruit. This study furthers the investigation of the biological properties of the fruits of the Cerrado, and possibly allow the use of these as functional foo