Biofilm formation and production of quorum sensing signaling molecules by strains of Salmonella spp. isolated from chicken processing

Resumo: Apesar da implantação de ferramentas e programas de controle para redução da incidência de Salmonella spp. nas granjas e abatedouros avícolas, a prevalência deste patógeno na cadeia produtiva avícola ainda é representativa. A adesão dos micro-organismos à superfície de equipamentos utilizados no processamento de alimentos resulta em graves problemas, pois atua como fonte de contaminação. Estes agregados de células com altas densidades populacionais presentes na superfície podem produzir moléculas sinalizadoras de quorum sensing responsáveis pela expressão de características fenotípicas específicas, dentre elas substâncias envolvidas na formação de biofilme. Uma vez instalado o biofilme, a resistência desses organismos aumenta, dificultando a ação dos sanitizantes, comprometendo a qualidade dos alimentos, além de aumentar os riscos à saúde pública. Um total de 65 cepas de Salmonella, sendo 39 isoladas de carcaças e cortes de frango e 26 isoladas de amostras de granjas, foi caracterizado quanto aos sorotipos e resistência a 24 antimicrobianos. O sorotipo Enteritidis foi o predominante representando 67,7% das cepas, seguido do sorotipo Newport com 7,7%. Um total de 10 padrões de resistência foi identificado,sendo que 96,9% das cepas apresentaram resistência a bacitracina, 87,7% a eritromicina, 83% ao ácido nalidíxico. Um total de cinco diferentes sorotipos isolados das aves vivas e também do produto final (Typhimurium, Enteritidis,Newport, Senftenberg e Infantis) foi avaliado quanto à formação de biofilmes à temperatura de 20°C após 2, 4, 8, 16, 24 e 48 horas nos meios de cultivo caldo de soja e tripticaseína (TSB) e água peptonada tamponada (APT) a 0,1%. Após 48 horas, as cepas avaliadas foram capazes de formar biofilmes sobre a superfície de cupons de aço inoxidável nos dois meios de cultivo, sendo Newport, o sorotipo que apresentou maior contagem de células aderidas em meio TSB. Em cultivo misto de Enterococcus faecalis ATCC 7080 e Salmonella Enteritidis, em meio TSB, verificou-se que ambos são capazes de formar biofilmes sobre a superfície de aço inoxidável de forma independente com predomínio do Enterococcus faecalis após 48 horas. Porém, em meio APT 0,1%, em cultivo misto, as células de Enterococcus faecalis aderiram à superfície somente após a adesão inicial das células de Salmonella Enteritidis. Os sanitizantes FARMASEPT PLUS® 0,1% e ácido peracético 300 ml.L-¹ foram os mais eficientes, seguido do hipoclorito de sódio a 5 mg.L-¹. O dióxido de cloro estabilizado a 100 mg.L-¹ se mostrou o menos eficiente com redução de apenas 1 log UFC/cm2 de células aderidas. Todas as 65 cepas de Salmonella também foram submetidas à pesquisa dos genes luxs e sdia relacionados ao sistema quorum sensing e à pesquisa de moléculas autoindutoras AI-2, utilizando o biossensor Vibrio harveyi BB170. Todas as cepas apresentaram os genes luxs e sdia e foram positivas para AI-2 nos testes de bioluminescência,com índices que variaram entre 1,13 a 1,30. Compreender a dinâmica de comunicação intercelular por meio de moléculas autoindutoras de quorum sensing e relacionar com a expressão de fatores de virulência pode esclarecer aspectos relevantes e possibilitar o desenvolvimento de estratégias para o controle de patógenos na indústria de alimentosAbstract: In spite of the implementation of control programs for Salmonella rating reduction in poultry breeding farms and slaughterhouses, the prevalence of this pathogenic agent, which is considered the main cause of foodborne diseases, is still significant. Microorganism adhesion and biofilm formation on food processing equipment surfaces result in severe problems, since they act as the source of food contamination. These cell aggregates have a high population density on the surface and may produce quorum sensing signaling molecules. These molecules are responsible for the expression of specific phenotypic characteristics, such as the substances involved in biofilm formation. Once the biofilm is present, the resistance of the organisms increases, impairing the action of sanitizing agents and compromising food quality, which raises the risks to public health. 65 strains of Salmonella, 39 isolated from broiler carcasses and 26 isolated from poultry breeding farms, had their serotypes and resistance to 24 antimicrobial agents characterized. The predominant serotype was Enteritidis (67.7% of the strains), followed by the Newport serotype (7.7% of the strains). A total of 10 resistance patterns were identified. 96.9% of strains were resistant to bacitracin, 87.7% to erythromycin and 83% to nalidixic acid. 5 different serotypes, isolated from poultry breeding farms and from the final product (Typhimurium, Enteritidis, Newport,Senftenberg and Infantis), had the biofilm formation evaluated at 20° C after 2, 4, 8, 16, 24 and 48 hours, in Tryptic Soy Broth (TSB) and 0.1% buffered peptone water (BPW) media. After 48 hours, the strains were able to produce biofilms on the surface of stainless steel coupons in both cultivation media. The Newport serotype, in TSB, presented the highest count of attached cells. Enterococcus faecalis ATCC 7080 and Salmonella Enteritidis, in mixed cultivation in TSB, were both able to produce biofilms on the surface of stainless steel independently, with the predominance of Enterococcus faecalis after 48 hours. However, the cells of Enterococcus faecalis attached to the surface only after the initial adhesion of Salmonella Enteritidis cells, in mixed cultivation in BPW. FARMASEPT PLUS® 0.1% and peracetic acid 300 ml.L-1 were the most efficient sanitizers, followed by sodium hypochlorite 5 mg.L-¹. Stabilized chlorine dioxide 100 mg.L-1 was the least efficient sanitizer, presenting an adhered cell reduction of only 1 log cfu/cm2. All 65 Salmonella strains were also subjected to gene probing for luxs and sdia genes, which are related to the quorum sensing system. Biosensor Vibrio harveyi BB170 was also used for all these strains to detect autoinducer AI-2 signaling molecules. All strains presented luxs and sdia genes. The bioluminescence tests were positive for AI-2, with values that ranged from 1.13 to 1.30. Understanding the intercellular communication dynamic, which occurs through quorum sensing signaling molecules, and its relation to the expression of virulence factors may clarify relevant aspects and make the development of pathogen control strategies in the food industry possibl