Fab fragments purification from enzymatic cleavage of human IgG : pseudo affinity chromatography using chelated metals and phenyl boronate as binding

As imunoglobulinas do tipo G humana (IgG) são amplamente empregadas em tratamentos terapêuticos contra câncer, doenças auto-imunes e imunodeficiência adquirida e na área analítica, em testes diagnósticos. Os fragmentos Fab podem ser obtidos por clivagem enzimática da molécula de IgG nativa ou por tecnologia de DNA recombinante. O fragmento Fab é composto por regiões constantes e variáveis, sendo que as regiões variáveis de cadeias leve e pesada compõem o fragmento Fv. Tanto os fragmentos Fab quanto os fragmentos Fv foram citados como segunda e terceira geração de anticorpos, respectivamente, e têm sido crescente o interesse em empregá-los em tratamentos terapêuticos, visto que ambos possuem menor massa molar em relação a IgG intacta e preservam a capacidade de se ligar ao antígeno. Como a utilização destas proteínas nas áreas terapêutica e analítica requer um alto grau de pureza, estratégias de purificação vêm sendo desenvolvidas. No intuito de contribuir para o desenvolvimento de processos de purificação de fragmento Fab, estudou-se o emprego de ligantes alternativos aos bioespecíficos proteínas A, G e L, comumente empregados para este fim. Neste trabalho, a purificação dos fragmentos Fab foi realizada por cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) e fenil boronato (FB). Quanto a IMAC, avaliou-se o efeito dos agentes quelantes IDA (ácido iminodiacético) e TREN (Tris 2(aminoetil) amina), os íons metálicos Cu2+, Ni2+ e Co2+ e os tampões Tris-HCl, fosfato de sódio e HEPES na ausência e na presença de NaCl para a purificação de Fab a partir de solução de clivagem enzimática de IgG humana policlonal. Os resultados foram analisados conjuntamente por Western blot e imunodifusão radial. No que se refere à pureza dos fragmentos Fab obtidos na etapa de flowthrough, a ordem crescente obtida foi TREN-Ni2+ (100%) > IDA-Ni2 (88,6%) > IDA-Co2+ (71,1%) > IDA-Cu2+ (63,9%). Em relação ao rendimento, obteve-se a seguinte ordem: TREN-Ni2+ (86,2%) = IDA-Co2+ (86,2%) > IDA-Ni2+ (74,3%) = IDA-Cu2+ (73,7%). No tocante à capacidade de adsorção de proteína total por mL de gel, obteve-se a ordem 14,3 mg mL-1 ( TREN-Ni2+) > 11,2 mg mL-1 (IDA-Ni2+) > 5,65 mg mL-1 (IDA-Cu2+) > 4,3 mg mL-1 (IDA-Co2+). O ligante FB adsorveu os fragmentos Fab e Fc e não promoveu a separação destes. Este trabalho possibilitou concluir que os agentes quelantes IDA e TREN com os íons metálicos empregados, possibilitam separar os fragmentos Fab de fragmentos Fc e obtê-los com grau de pureza satisfatório.Polyclonal human G immunoglobulins are widely applied in therapeutic treatments for cancer, autoimmune diseases and immunodeficiency and in the analytical area of diagnostic testing. The human IgG Fab fragments can be obtained via enzymatic cleavage of the native molecule or recombinant DNA technology. The Fab is composed of constant regions (CL and CH) and variable (VL and VH). The variable regions of the light and heavy chains comprise the Fv fragment. Fab fragments and Fv fragments were cited as second and third generation of antibodies, respectively, and has been an increasing interest in employing them in therapeutic treatments, as both have molecular weight less than the intact IgG and preserve the affinity for the antigen. The applied these proteins in therapy and analytical investigation require a high degree of purity, so, different purification strategies have been developed. In order to contribute to the development of Fab fragment purification processes, we studied the use of alternative biospecific binding to proteins A, G and L, commonly applied for this purpose. In this work, the purification of the Fab fragments was performed by affinity chromatography with chelated metals (IMAC) and phenyl and boronate (PB) ligand immobilized on agarose gel. In this investigation, the metal chelates Cu 2+, Ni 2+ and Co 2+ were studied when tested in IDA (iminodiacetic acid) and TREN (Tris 2 (aminoethyl) amine) and buffer system Tris-HCl, sodium phosphate and HEPES with or without NaCl for purification of Fab fragments from enzymatic cleavage solution of polyclonal human IgG. The results of Western blot and radial immunodiffusion were analyzed together. For the purity of the Fab fragments obtained in flowthrough, the increasing order was obtained TREN-Ni2+ (100%) > IDA-Ni2+ (88.6%) > IDA-Co2+ (71.1%) > IDA-Cu2+ (63.9%). In relation to yield, we obtained the following order: TREN-Ni2+ (86.2%) = IDA-Co2+ (86.2%) > IDA-Ni2+ (74.3%) = IDA-Cu2+ (73.7% ). With regard to the total capacity protein adsorption per ml of gel, was obtained the order 14.3 mg mL-1 (TREN-Ni2+) > 11.2 mg mL-1 (IDA-Ni2+) > 5.65 mg ml -1 (IDA-Cu2+) > 4.3 mg ml-1 (IDA-Co2+). The binder FB adsorbed Fab and Fc did not cause separation thereof. This work led us to conclude that the chelating agents IDA and TREN with the metal ions used, enable separate the Fab fragments of Fc fragments and get them with satisfactory degree of purity