Improvement of enzymatic cocktails for sugar cane bagasse hydrolysis

O alto custo da hidrólise enzimática para a conversão de biomassa lignocelulósica é um problema recorrente que limita a produção de bioetanol a partir desta fonte renovável e altamente energética. Muitos fatores afetam a eficiência do processo de hidrólise, como a recalcitrância do substrato lignocelulósico, eficiência do pré-tratamento, proporções e cargas das enzimas, inibidores e perda de atividade devido à adsorção não específica. Somado a estes fatores, o alto custo de produção de coquetéis enzimáticos limita a carga enzimática, o que contribui para a inviabilização técnica e econômica do processo. Dentre as abordagens consideradas promissoras para otimizar a reação de hidrólise, pode-se destacar o desenvolvimento de coquetéis artificiais bem balanceados envolvendo diferentes classes de enzimas. Este projeto estuda coquetéis enzimáticos otimizados para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, onde as enzimas provieram tanto de fonte comercial quanto de cultivos microbianos (Trichoderma reesei e Escherichia coli geneticamente modificada), seguidas de purificação. Planejamento experimental de mistura lattice simplex, seguido de planejamento fatorial, foram utilizados para a otimização da proporção enzimática. Em ambos os experimentos, a concentração de glicose liberada (g/L) foi a resposta avaliada. A fim de se reduzir o consumo de reagente, as hidrólises foram conduzidas em escala reduzida, cuja metodologia foi validada neste trabalho. A mistura enzimática otimizada, compreendida da fração T. reesei (80%), endoglucanase (10%) e ?-glicosidase (10%), foi capaz de converter 68,36% ± 5,57 da celulose contida no bagaço hidrotérmico, enquanto que os coquetéis comerciais Cellic CTec H2 e Celluclast converteram 70,43% ± 5,03 e 49,11% ± 0,49 do mesmo material, respectivamente, sob as mesmas condições de operação. Desta forma, este trabalho contribuiu com a identificação de atividades necessárias e de suas proporções ótimas para melhorar o coquetel enzimático de T. reesei, resultando no aumento da conversão do bagaço hidrotérmico. As estratégias de purificação de proteínas e análises de planejamento experimental e de sinergismo podem ser empregadas para a obtenção de coquetéis melhorados feitos sob medida para a hidrólise de outros materiais.The high cost of converting lignocellulose by enzymatic hydrolysis is a recurring problem that limits the production of bioethanol from a renewable and highly energetic source. Many factors affect the efficiency of the hydrolysis process, such as lignocellulosic substrates recalcitrance, pretreatment efficiency, enzyme ratios and loadings, inhibitors and non-productive adsorption. Furthermore, the high production costs of enzyme cocktails limit the enzyme loads, which contribute to technical and economic infeasibility of this process. Among the promising approaches to optimize hydrolysis reaction, there is the development of well-balanced cocktails involving different classes of enzymes. This project studies optimized enzyme cocktails for hydrolysis of pretreated sugar cane bagasse, where the enzymes were provided from both commercial source and microorganism cultivation (Trichoderma reesei and genetically modified Escherichia coli), followed by purification. Experimental simplex lattice design, followed by factorial design, were performed to optimize the enzymatic proportion. In both experiments, released glucose concentration was the result evaluated. To reduce reagent consumption, the hydrolysis was carried out in micro assays scale, which methodology was validated in this study. The optimized enzyme mixture, comprised of T. reesei fraction (80%), endoglucanase (10%) and ?-glucosydase (10%), was capable of converting 68,36% ± 5,57 of the cellulose present in hydrothermal pretreated bagasse, whereas commercial cocktails Cellic CTec H2 and Celluclast converted 70,43% ± 5,03 e 49,11% ± 0,49 of the same material, respectively, under the same conditions. Thus, the work reported here contributed to the identification of needed activities and their optimal proportions to improve T. reesei enzymatic cocktail, enhancing hydrothermal bagasse conversion. Protein purification strategies and analyses of experimental design and synergism can be used to obtain improved cocktails to hydrolyze other materials