Functional characterization of the ScCIPK8 gene from sugarcane (Saccharum spp.)

A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas vegetais do mundo, sendo o Brasil o principal produtor. A relevância mundial desta planta tem aumentado e muito tem sido investido na obtenção de variedades de cana-de-açúcar com maiores teores de sacarose e mais resistentes a estresses bióticos e abióticos. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente o gene ScCIPK8, relacionado ao acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. Com a finalidade de elucidar as redes de interação da proteína ScCIPK8, ensaios de duplo-híbrido em leveduras foram realizados. Foi identificado que a proteína ScCIPK8 interage com as proteínas ScCBL1, ScCBL3 e ScCBL6, mas não interage com as proteínas ScCBL2, ScCBL9 e ScCBL10. As interações identificadas em leveduras foram confirmadas in planta por ensaios de BiFC. No intuito de identificar alvos de interação diferentes das proteínas CBLs, foram realizados screenings de duas bibliotecas de cDNA transformadas em leveduras. Foram identificadas a interação da proteína ScCIPK8 com as porções C-terminal de uma provável proteína do tipo PP2C e de uma provável proteína MYC2. Avaliamos adicionalmente a resposta à seca do gene ScCIPK8 e dos seus alvos de interação através de ensaios de PCR em tempo real. O gene ScCIPK8 é induzido em uma variedade de cana-de-açúcar tolerante à seca após dois dias de estresse hídrico e é induzido após quatro dias de estresse hídrico, tanto na variedade sensível quanto na tolerante à seca. Por outro lado, o gene ScPP2C-1 é induzido apenas na variedade tolerante à seca após dois dias de estresse hídrico. As expressões dos genes ScCBL1 e ScCBL6 não foram alteradas de forma significativa nas condições testadas. Por outro lado, a expressão do gene ScCBL3 foi reprimida nas plantas da variedade tolerante sob quatro dias de seca e manteve-se inalterado em todas as outras condições testadas. Por fim, plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana transformadas com o gene ScCIPK8 foram obtidas e avaliadas quanto à resistência a estresses hídrico e salino. Não foi verificada diferença significativa na tolerância das plantas transformadas com o gene ScCIPK8 em relação aos controles utilizados.Sugarcane is one of the most important crop plants in the world and Brazil is the leading manufacturer. The world importance of sugarcane is increasing and much has been invested on obtaining better plants with increasing sucrose content and resistance to biotic and abiotic stresses. The present work aims to characterize the sugarcane ScCIPK8 gene involved in sucrose accumulation. To gain insights on the ScCIPK8 protein-protein interaction network, yeast two-hybrid assays were conducted. It was shown that ScCIPK8 protein interacted with ScCBL1, ScCBL3 and ScCBL6, but not with ScCBL2, ScCBL9 and ScCBL10. BiFC assays were conducted to confirm in planta the interactions observed in yeast cells. Yeast two-hybrid screenings using two different cDNA libraries were conducted to identify unknown targets of ScCIPK8 protein. It was shown that ScCIPK8 interacted with the C-terminal portions of a putative PP2C and a putative MYC2 protein. We also performed qPCR assays in order to evaluate the drought response of ScCIPK8 gene and its target genes. ScCIPK8 gene expression was induced in a tolerant sugarcane variety after two days of drought stress and was induced in both the sensitive and tolerant sugarcane varieties after four days of drought stress. On the other hand, ScPP2C-1 gene expression was induced in the tolerant variety after two days of drought stress. The expression of ScCBL1 and ScCBL6 was not significantly changed under the tested conditions, while ScCBL3 expression was repressed in the tolerant variety after four days of drought stress. Finally, Arabidopsis thaliana transgenic plants overexpressing ScCIPK8 were obtained and evaluated for their resistance to drought and salinity stresses. We could not observe any significant difference regarding drought tolerance between control and transgenic plants transformed with ScCIPK8