Identification of Nod like receptors (NLRs) in human atherosclerotic plaques and inflammatory role of NLRP3 and IL-1 beta

A presença de IL-1β e IL-18 em lesões ateroscleróticas e o importante papel dessas citocinas na ativação endotelial, recrutamento celular e na polarização para a resposta TH1 constitui indício indireto do envolvimento dos NLRs na patogênese da aterosclerose. Nesse trabalho investigamos a presença do RNAm e proteína de diversos NLRs, AIM2, caspase-1, proteína adaptadora ASC e IL-1β em placas ateroscleróticas humanas. Observamos que amostras de ateroma de pacientes assintomáticos apresentaram maior expressão relativa do RNAm de NLRP1, 2 e 3, NLRC2, 3, 4 e 5, NAIP e ASC. A presença de fatores de risco não promoveu diferenças na expressão gênica do RNAm para nenhum deles. A marcação por imuno-histoquímica revelou a presença de NLRP1, 3, AIM-2, NLRC2, 3 e 5 e caspase-1, especialmente em macrófagos, células gigantes e células espumosas. Em culturas de monócitos do sangue periférico, macrófagos humanos derivados de monócitos e células da linhagem monocítica THP-1 estimuladas com LPS, a presença de cristais de colesterol teve efeito aditivo na produção de IL-1β. Por outro lado, os inibidores farmacológicos inibiram a produção dessa citocina em células THP-1 após o estímulo com cristais de colesterol. A atividade da citocina IL-1β também foi avaliada pela capacidade de induzir a produção de mediadores inflamatórios por células musculares lisas e células endoteliais. Catepsina S, MMP3, CXCL10, CXCL16 e CX3CL1 foram produzidas apenas por células musculares após o estímulo, mas CCL2, CXCL8 e CCL5 foram produzidos tanto por células musculares quanto por células endoteliais estimuladas. Em conclusão, nosso trabalho mostrou a presença de RNAm e proteína de diversos NLRs em placas de ateroma humano. Além disso, mostramos o papel dos cristais de colesterol na ativação de monócitos e macrófagos produtores de IL-1β provavelmente via NLRP3, expresso em grande quantidade nas placas analisadas. Finalmente, os experimentos de estimulação de células musculares lisas e endoteliais ressaltaram a importância da IL-1β como agente inflamatório e desestabilizador das lesões, confirmando seu potencial como alvo terapêutico visando a contenção do processo inflamatório que caracteriza a aterosclerose.The presence of IL-1β and IL-18 in atherosclerotic lesions and their important role in endothelial activation, cell recruitment and switch to Th1 response, are indirect indications of the involvement of NLRs in disease pathogenesis. In this study we investigated the presence of mRNA and protein of various NLRs, AIM2, caspase-1, adaptor protein ASC and IL-1β in human atherosclerotic plaques. We observed that atheroma samples from asymptomatic patients had higher mRNA relative expression of NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRC2, NLRC3, NLRC4, NLRC5, NAIP and ASC. Risk factors have no influence in mRNA expression for any of them. Immunohistochemistry technique revealed the presence of NLRP1, NLRP3, AIM-2, NLRC2, NLRC3, NLRC5 and caspase-1, especially among macrophages, giant cells and foam cells. The presence of cholesterol crystals in monocytes and macrophages cultures stimulated with LPS, had an additive effect on IL-1β production. On the other hand, pharmacological inhibitors inhibited this cytokine production by THP-1 cells stimulated with cholesterol crystals. The ability of IL-1β to induce inflammatory mediators production by smooth muscle cells and endothelial cells was also evaluated. Cathepsin S, MMP3, CXCL10, CXCL16 and CX3CL1 were produced only by smooth muscle cells after stimulation, but CCL2, CXCL8 and CCL5 were produced by both smooth muscle cells and endothelial cells. In conclusion, our study revealed the presence of various NLRs mRNA and protein in human atherosclerotic plaques. Furthermore, we demonstrated the role of cholesterol crystals in the activation of IL-1β producers monocytes and macrophages, probably due to NLRP3 expressed in large amounts on the lesions analyzed. Finally, stimulation of smooth muscle cells and endothelial cells highlighted the importance of IL-1β as an inflammatory and destabilizing agent in lesions, confirming its potential as a therapeutic target that could restrain the prevailing inflammation in atherosclerosis