Immobilization of laccases and microrganisms in biocatalysis

Estudou-se e foram desenvolvidos biocatalisadores baseados em duas técnicas de imobilização: em gel de alginato (com/sem revestimento de quitosana) e em nanossílica funcionalizada. Foram preparados biocatalisadores com lacases (comercial e do caldo enzimático de crescimento do fungo Pycnoporus sanguineus, sob ação de indutores de atividade enzimática), utilizados em reações de oxidação de alcoóis, na decomposição de fármacos e em descoloramento de corantes azo. Também foram preparados biocatalisadores por imobilização de células íntegras de 4 microrganismos, utilizados em reações de redução de enonas. As lacases foram imobilizadas em esferas de alginato de cobre além de poderem ser revestidas com quitosana. A quitosana aumentou a resistência mecânica das esferas e possibilitou que fossem utilizadas por até 3 vezes sucessivas. As reações de oxidação de alcoóis feitas com alginato revestido com quitosana forneceram porcentagens de produto inferiores a relatado na literatura (~50% contra 80% da literatura) e, por isso, essa técnica foi substituída por outra, baseada em nanossílica funcionalizada. A técnica de imobilização de lacases em nanossílica funcionalizada forneceu maiores porcentagens de produtos de oxidação do que a de imobilização em gel, havendo 100% de conversão inicial do substrato (álcool para-metoxibenzílico) quando é utilizado o mediador TEMPO. É possível utilizar este biocatalisador por até 10 vezes, sendo esta a técnica de escolha para essa reação de oxidação de alcoóis com o sistema lacase mediador. A imobilização de lacases em nanossílica funcionalizada também mostrou-se capaz de decompor fármacos (diclofenaco, estradiol, ciprofloxacina, naproxeno e norfloxacina), se colocando como uma alternativa complementar para sistemas de tratamento de águas. O descoloramento de corantes azo pelas esferas de alginato contendo lacases foi estudado tanto com esferas contendo lacase comercial como com o caldo enzimático sob indução. Ambas demonstraram capacidade de descolorir todos os corantes testados, por até 4 ciclos, sendo que a utilização do mediador HBT ampliou as porcentagens de descoramento (~40/50% sem HBT contra ~70/85% com HBT). As esferas contendo caldo enzimático apresentaram resultados ligeiramente superiores, ambas com HBT (85% do caldo enzimático contra 70% da enzima comercial). O biocatalisador com células de microrganismos (S.cerevisiae, R.glutinis, C.albicans e G. candidum) foi preparado em esferas de alginato de cálcio e também em esferas de alginato de cálcio revestidas com quitosana, o que alterou as propriedades e forneceu resultados diversos daquelas sem quitosana, permitindo o controle quimiosseletivo do processo reacional para alguns dos substratos. Os biocatalisadores com células em gel apresentaram algumas vantagens em relação às células livres, já que não ocorrem as emulsões durante o processo de isolamento, não se observou desalogenação, contorna-se a morte das células possibilitando que as reações sejam mantidas por mais tempo ou com maior quantidade de substrato e, em alguns casos, houve aumento do excesso enantiomérico, mostrando que esta técnica tem grande versatilidade e ainda atribuiu características de controle do processo reacional, o que é difícil ou mesmo impossível de ser feito com células livres.In this work biocatalysts based on two immobilization techniques were developed and studied: those based on alginate gel entrapping (with or without an outer chitosan layer) and those based on functionalized nanosilica linkage. Laccase-based biocatalysts were prepared and used in the oxidation of alcohols, degradation of pharmaceuticals and bleaching of azo dyes. Both commercial laccase and laccase obtained from the fungus Pycnoporus sanguineus under enzymatic activity inductors were used. Biocatalysts for the reduction of enones were also prepared by immobilization of whole cells from four different microorganisms in calcium alginate. Laccases were immobilized in copper alginate, in some experiments being covered by a layer of chitosan. The chitosan layer enhanced the spheres¿ mechanical resistance, making it possible for them to be reutilized up to three successive times. Alcohol oxidations carried out by laccases in alginate beads covered by chitosan yielded lower conversions to those reported in the literature (ca. 50% versus 80% from the literature), and, thus, this technique was replaced by another one based on functionalized nanosilica. This immobilization technique yielded a higher amount of the oxidation product than the gel immobilization, and up to 100% conversion was achieved for the model substrate (p-methoxybenzyl alcohol) when TEMPO was used as the mediator. It was possible to use this biocatalyst up to ten times, ultimately being the chosen technique for the alcohol oxidations using the laccase-mediator system. Functionalized nanosilica-immobilized laccases were also able to decompose pharmaceuticals (diclofenac, estradiol, ciprofloxacin, naproxen and norfloxacin), presenting itself as a complementary alternative to water treatment systems. Azo dye bleaching by alginate-entrapped laccases was studied using both commercial laccase and the enzymatic broth under induction. Both showed capability of decolorizing all inspected dyes, for up to four cycles, and the utilization of the mediator HBT enhanced the decolorizing percentage (ca. 40-50% without HBT versus ca. 70- 85% with HBT). Beads containing the enzymatic broth presented slightly superior results, both with HBT (85% for the enzymatic broth versus 70% with the commercial enzyme). Whole-cell biocatalysts were prepared with microorganisms (S. cerevisiae, R. glutinis, C. albicans and G. candidum) entrapped in calcium alginate beads with or without an outer chitosan layer. The chitosan layer altered the beads¿ properties, as well as the reduction outcomes, allowing the chemoselectivity control for some of the substrates. Gel-entrapped biocatalysts presented some advantages compared to those with free cells, since no emulsion was observed in the reaction workups, no dehalogenation was observed in the case of halogenated enones, cell death could be delayed, making it possible for reactions to be carried out for more time and with greater amounts of substrate, and in some cases, an enhancement of enantiomeric excess was observed. These results show that it is a very versatile technique that can be used as a strategy for the control of the biocatalytic reactions, which is harder to achieve when free cells are employed