Influence of titanium nitride by cold-plasma on formation and development of multiespecies biofilms

Tratamentos que alteram propriedades de superfície de titânio são realizados em implantes odontológicos visando uma melhor sinalização celular e a neoformação óssea. Porém, em determinadas situações clínicas, as superfícies de titânio expostas ao meio oral recobertas por película adquirida (PA) podem se tornar substratos para o desenvolvimento de biofilmes associados às doenças inflamatórias, como a peri-implantite. Diante desta observação, os objetivos deste estudo foram (i) caracterizar a superfície de titânio nitretada por plasma a frio quanto às propriedades de rugosidade, topografia, composição química e energia livre de superfície (ELS); (ii) determinar o perfil protéico da PA adsorvida às superfícies (iii) avaliar a influência do tratamento de superfície na formação e desenvolvimento de biofilmes multiespécies. Para o estudo, discos de titânio grau IV receberam polimento e acabamento e foram divididos aleatoriamente no grupo controle (Ti) e experimental TiN (nitretado por plasma a frio). As superfícies foram caracterizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a rugosidade e topografia determinadas pela Microscopia de Força Atômica (n = 4). A ELS foi avaliada pela técnica ácido-base e leitura em goniômetro (n = 9) e a composição química da superfície foi determinada por Espectroscopia Fotoeletrônica de Raios-X (XPS) (n = 4). Em seguida, os discos foram imersos em saliva para formação de PA por 2 horas e novamente a ELS foi determinada (n = 6). O perfil protéico da PA foi determinado por espectrometria de massas LC-MS/MS (n = 18). Um biofilme composto por um fungo e seis bactérias (Candida albicans, Veillonella dispar, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Fusubacterium nucleatum e Actinomyces naeslundii), foi desenvolvido durante 64,5 horas sobre os discos com película. Após este período, os micro-organismos e o biofilme total foram quantificados em células viáveis (n = 12). A topografia e a organização dos biofilmes foram analisadas por MEV e pela microscopia confocal a laser. Os dados de células viáveis e perfil protéico foram avaliados estatisticamente pelo Teste t de Student e os dados de ELS pela análise de variância (ANOVA) de dois fatores seguida pelo teste de Tukey com nível de significância de 5 %. Os resultados demonstraram não haver diferença entre as propriedades de rugosidade e topografia entre os grupos e um maior pico de nitrogênio foi detectado na composição química da superfície nitretada. O tratamento não alterou a ELS, que aumentou apenas na presença de PA (p < 0.001). Diferentes proteínas se adsorveram a superfície nitretada. A quantidade de células viáveis do biofilme formado nas duas superfícies foi semelhante (p = 0.416), confirmado pelas microscopias, porém Fusobacterium nucleatum e Streptococcus oralis foram quantificados em maior número nos biofilmes do grupo TiN. Conclui-se que a nitretação por plasma a frio não alterou as propriedades de superfície de titânio e não influenciou a quantidade de biofilme formado. Porém, a superfície nitretada aumentou as contagens de Fusobacterium nucleatum e Streptococcus oralis e selecionou diferentes proteínas na PA.Surface treatments that alter titanium properties titanium are performed on dental implants in order to improve the cell signalization and bone formation. Although, in certain clinical situations, the surfaces exposed to oral cavity covered by acquired-pellicle (AP) may become substrates for development of biofilms associated with inflammatory diseases as periimplantitis. Given this observation, the aims of this study were (i) to characterize the surface properties of titanium nitride by cold plasma as roughness, topography, chemical composition and surface free energy (SFE), (ii) determine the protein profile of AP adsorbed to the surfaces (iii) evaluate the influence of surface treatment on formation and development of multispecies biofilms. For the study, titanium discs grade IV received polish and finish and were randomly allocated to control (Ti) and experimental TiN (nitride by cold-plasma) groups. The surfaces were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and roughness and topography determined by Atomic Force Microscopy (n = 4). The SFE was evaluated using the acid-base technique and read in goniometer (n = 9). The surface chemical composition was determined by x-ray photo-electron spectroscopy (XPS) (n = 4). Then, the discs were immersed in saliva for AP formation per 2 hours and again the SFE was determined (n = 6). The AP protein profile was determined by mass spectrometry LC-MS/MS (n = 18). A biofilm composed by five bacteria and one fugal (Candida albicans, Veillonella dispar, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii and Fusobacterium nucleatum) was conducted for 64.5 hours on coated-discs. After this period, the viable cells of biofilms were determined (n = 12). The biofilms topography and organization were analyzed by SEM and by confocal laser microscopy. The data of viable cells and protein profile were evaluated statistically by Student's t test and SFE data by two-way ANOVA followed by Tukey's test with a significance level of 5%. The results showed no difference between the properties of roughness and topography in groups. A high peak of nitrogen was detected in the chemical composition of the nitride surface. The treatment did not alter the SFE, that increased in the presence of AP (p